牛BMP4基因3末端序列克隆与分析.pdf

牛BMP4基因3’末端序列克隆与分析 王峰“2，刘永斌“2，荣威恒1 (1．内蒙古畜牧科学院，内蒙古呼和浩特010030； 2．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特010018) 摘要：BMP4基因主要在动物早期胚胎中表达，是与哺乳动物身体形态的形成有重要关联的基 因。本文参考人和老鼠BMP4基因序列信息，设计上下游引物，扩增牛的BMP4基因部分cDNA序列， 根据此序列设计特异引物。从牛软骨中快速抽体总RNA，以此RNA为模板，经RACE法获得特异片 段，井将该片段克隆到PMDl8一T载体中，转化大肠杆菌感受态细胞EcoliDIDa。将含有外源片段的 克隆质粒经PCR、酶切和测序验证，获得了牛BMP4 3端的序列并进行序列分析。结果表明，牛BMP4 基因与禽类和哺乳类动物的保守性非常高(70％以上)，其中与羊的保守性最高，达到94％。 关键词：牛；BMP4；RACE；克隆；序列分析 1965年美国人Ufist”’41发现将脱钙骨基质明胶植人小鼠的肌肉内，可以诱导生成新的软骨和骨， 由此认为在骨基质明胶中可能存在某种具有诱骨活性的特殊因子，并将其命名为骨形态发生蛋白 化的间质细胞分化增殖、形成软骨和新生骨，这种骨诱导作用无种属特异性”】。 随着社会的进步与发展，人们对家畜产品的需求13益增加，在家畜品种改良与新品种育种等方 面开展了深入和多方面的研究。鉴于BMP4在骨骼形成过程中的重要作用，一些学者也开始在家畜 领域展开相关的研究。 本实验根据已知人、小鼠的BMP4基因保守序列，设计并合成特异引物，应用RACE法，成功克隆 了牛的BMP4基因，并对该基因序列进行了分析。旨在为牛BMP4基因全序列的克隆与表达以及研 究该基因在牛生长发育过程中的作用机制提供基础资料。 1材料和方法 1．1材料 牛的各种新鲜组织由内蒙古畜牧科学院试验示范牧场提供，液氮保存并取回实验室。蛋白酶K、 Ladder2000(分子量为2000、 HindⅢ和EcoRI限制性内切酶购于Promega公司；pMDl8一TVector、DNA 1000、750、500、250、100)bp、kDNA／HindILI 盒购于杭州维特洁生化技术有限公司；日常型质粒小量制备试剂盒购于北京天为时代生物技术有限 公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、胰蛋白胨、酵母提取物购自上海生工公司；SDS、酶焦磷酸 二乙酯(DEPC)购于Sigma公司；总RNA提取试剂盒(Trizol (Cat．NO．1)6121)购自TaKaRa公司。 1．2牛血DNA的提取 牛血液总DNA的提取主要参照《分子克隆实验指南》”o的方法进行。 1．3总RNA的提取 主!!全垦．查±登学研讨会文集 养牛科学技术研究进展 牛软骨RNA的提取，按照Trizolregent说明进行。 1．4引物设计 采用DNAstar．洲：，参考GenBank中公布人和小鼠BMP4 cDNA的保守序列，设计一对引物。PCR 特异引物。引物序列及PCR得到的目的片断见表1。引物均有赛百盛试剂公司合成。 表1牛BMP4的引物序列及PCR扩增得到的目的片段 1．5牛BMP4基因3’末端序列的扩增 PCR反应，扩增3’端序列。反应条件如下：94。C30s，60：Clmin。72℃5min，40个循环；最后72℃延伸 7min。取5出PCR产物进行凝胶电泳鉴定。 1．6目的基因的克隆与鉴定 将含目的基因片段的PCR产物纯化回收后，克隆于PMDl8一T载体中，转化JMl09感受态细胞， 在LB培养基中过夜培养，用碱裂解法提取质粒，以PER法和酶切法鉴定阳性重组子。阳性重组子的 测序由宝生物(大连)工程公司完成。 1．7牛BMP4 3’端序列分析 使用DNAstar生物学软件，对牛BMP4 3’端序列进行分析，并与其他物种的BMP4序列进行}E较。 2结果