生物法合成13丙二醇过程中的辅酶代谢调控.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 生物法合成1，3一丙二醇过程中的辅酶代谢调控 张延平1”，黄志华1，李寅2，曹竹安1 (1．清华大学化工系}2．中科院微生物所) 摘要：本文以1，3-丙二醇生物合成过程中必需的辅酶NADH为调控对象，利用两种基因 0F-1及醛脱氢酶失活 改造菌株——甲酸／甲酸脱氢酶：NADH再生重组菌K．pneumoniae 重组菌K．pneumoniaeDA-1HB，分别研究了NADH“开源”和“节流”两种举措对提高胞内 NADH驱动力的作用，以及这两种举措对1，3一丙二醇合成的影响。结果表明，两种基因改 造措施都可以提高1，3-丙二醇最终合成浓度，达到65-70g／1。但两种举措对胞内NADH积 累及甘油代谢的影响差异很大，引入NADH再生体系后，胞内1，3-丙二醇、乙醇等消耗 NADH的途径均得到加强，胞内仍维持NADH-NAD平衡，1，3-丙二醇得率变化不大，而故 除醛脱氢酶基因削弱乙醇合成途径的方案中，胞内NADH积累浓度明显高于出发菌株，菌 体生长受到一定抑制，甘油消耗量大大降低，1，3-丙二醇摩尔得率达到0．692，比出发菌株高 90％左右． 关键词：l，3一丙二醇；辅酶NADH；代谢调控 前言 生物法生产1，3一丙二醇(1，3-PD)近年来受到重视，但其合成过程不能独立进行。这 成必须与甘油的氧化代谢途径耦合进行。对于这种复杂体系，单一代谢调控比较难于奏 效。Saint—Amems等[I]发现通过调节底物中甘油／葡萄糖的比例，可以改变底物代谢流。 NADH，从而改变了菌体代谢流。本课题组从联系底物氧化与还原反应过程的共同媒介 ——辅酶NADH人手，对1，3-PD生产菌K．pneumoniaeYMU2进行基因工程改造，分 OF一1及醛脱氢酶失活重组菌DA一 别构建了甲酸脱氢酶表达重组菌K．pneumoniae 1HB，以期从改变胞内NADH再生效率及有效利用率的角度提高胞内NADH有效驱动 生长和代谢的影响。 1 材料与方法 1．1实验菌株及培养条件 1．1．1实验菌株 YMU2，由本课题组保藏∞。在此基础上， 本文所用的对照菌株是K．pneumoniae 本课题组构建了两株重组菌：DA一1HB是将YMU2的醛脱氢酶基因敲除，以期通过削弱 张延平等：生物法合成l，3一丙二醇过程中的辅酶代谢调控 副产物乙醇合成途径降低副产物对NADH的消耗[13；OF一1是利用表达质粒将引入甲酸 脱氢酶基因，以期通过引入甲酸／甲酸脱氢酶体系提高NADH再生效率-。 1．1．2培养基及培养条件 菌株培养所用培养基中甘油初始浓度为30g／L，发酵过程中甘油浓度控制为10一30 g／L，其它组分见文献1-83。菌株培养在德国B．Braun公司生产的5l发酵罐中进行，厌氧 培养阶段通人普通氮气(纯度99．9％)维持厌氧，通气量约0．8VVM。 1．2方法 1．2．1菌体浓度测定 菌体浓度通过测定发酵液在650nm处的吸光度值OD650来衡量。 1．2．2底物甘油及主要代谢产物浓度测定 10A型高效液相 HPX 色谱测定。色谱柱为Aminex87H柱，柱温65℃；流动相为0．005mol／l的 H2SO‘，流速为0．8ml／min；检测器为RID10A型折光示差检测器。[9] 1．2．3NADH浓度测定 辅酶NAD、NADH浓度利用酶循环法测定[10]。 2 结果与讨论 2．1 NADH再生系统引入及醛脱氢酶失活对K．pneumoniae菌体生长的影响 如图1所示，在5l发酵罐中，基因工程菌K．pneumoniaeOF-1与其出发菌株 YMU2的生长规律基本一致：发酵前期0F一1与YMU2都较快速生长，30