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A07蛋白折叠液相色谱法 耿信笃+于超展白泉 西北大学现代分离科学研究所现代分离科学陕西省重点实验室西安710069 液相色谱(LC)与蛋白折叠(proteinfolding)是化学和生物化学中分别使用的两个术语，而 蛋白折叠液相色谱法却是一个鲜为人知的专用名词。1997年英国剑桥大学的一个研究小组曾 提出再折叠色谱(refolding refolding 确切，而且没有对它们下定义。这里讲的蛋白折叠液相色谱法，不仅是指在操作上将含变性 蛋白样品溶液进样到LC柱上，再从流出液中接收目标蛋白的这样一种简单的操作方法，而是 包含着如何将变性蛋白复性这样一个复杂过程在色谱柱上完成，结合色谱有很好的分离效果 的特点。达到单独用通常复性方法和单独用通常的液相色谱法无法达到的蛋白复性并同时纯 liquid 化的效果。因此蛋白折叠液相色谱法(proteinfoNing 为：有液相和固相起协同作用的，能实现蛋白折叠并满足质量控制所涉及到的多种物理及化 学过程的液相色谱法。这个定义包括了四个方面的内容：一是固相和流动相各自及其二者的 协同作用对蛋白折叠均有不同贡献；■是必须能使目标蛋白完全或部分完成了折叠；三是所 讲的质量控制包含正确折叠中间体和天然构象蛋白的形成，错误折叠中问体向正确折叠中间 体的转换以及正确折叠的蛋白与错误折叠的蛋白中间体的色谱分离。四是所指的多种物理或 化学过程包括生成沉淀和溶解，氧化和还原，酸碱中和，缔合和解离等。由此看出，蛋白液 相色谱折叠法不仅是一种新的蛋白折叠方法，而且是一种新的液相色谱方法。 一个理想的PFLC具有四种功能，即除变性剂，变性目标蛋白复性，与杂蛋白分离，便于 回收变性剂，从而达到“一石四鸟”的效果。一般只要20-40分钟就能完成一个色谱过程。 此外，因所用流动相可以连续改变其组成，故多种变性蛋白会各自“选择”适台自己的复性 条件，～次色谱过程可使多种蛋白同时复性并实现纯化。 复性并同时纯化，虽然当时得到的目标产品的纯度仅85％，但比活已高达5．7×10’IU·mg～。这 一科学上的重要发现表明LC法有可能成为一种新的蛋白折叠下具。1994年，捷克、美国和 对变性蛋白进行了复性。1997年英国剑桥大学的一个研究组将分子伴侣、二硫键氧化酶和脯 氨酸顺反异构酶三种组分键台在固定相表面后，用其对Cyclophilin进行了复性，而用其它方 o 珐根本无珐复性Cyclophilin”I and purificationofproteins，USRPP)，或称其为色谱饼(chromatographic 工业化成为可能。2000年我们首次测定了变性蛋白在用于变性蛋白折叠的HPHIC固定相表面 的折叠自由能9】，并发现固定相表面为变性蛋白分子能提供较高的能量。在此基础上，2001 年我们又发表了“疏水色谱对变性蛋白复性并同时纯化机理及应用”[101o这一研究从微观上 阐明了用HPHIC进行蛋白折叠的分子学基础，认为同定相、流动相以及二者问的协同作用促 并同时纯化的报道II“。这是首次在工业生产中用PFLC法对变性蛋白进行复性并同时纯化。 PFLC的原理是利用目标蛋白和变性剂在色谱过程中的洗脱时间不同，使得目标蛋白分 子周围的变性剂被除去或使其浓度降低，从而使目标蛋白复性，利用变性蛋白在凝胶孔中的 相互隔离，从面降低了变性蛋白分子间的聚集和沉淀，使质量回收率和活性回收率得到提高。 edu，cn 通讯联系人：Tel／Fax：(029)^衄eng@nwu O 另外，PFLC中的液固界面可以为蛋白折叠提供较高的折叠自由能，以促使其顺利复性。 对于蛋白质的色谱复性，存在一个严重的问题：在进样的时候会形成聚集。如果聚集发 生了，色谱柱的反压会明显升高，甚至会将色谱柱堵住，使复性操作无法进行。在大规模LC 复性中，这一问题显得更为重要。本实验室设计开发的蛋白复性并同时纯化装置(USRPP， 图1)能够较好地克服上述缺点，其最大优点是，除了仍具备通常色谱柱所具有的“一石四 鸟”功能外，还能在进样或色谱