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高效快速降脂动物模型研究 　　[摘要]探讨斑马鱼作为降脂药物筛选模型的可行性以及盐酸小檗碱（BBR）对高脂斑马鱼的影响。用含4%胆固醇饲料喂养3月龄斑马鱼0，2，4，8，14，20，25，30d，检测血清总胆固醇含量的变化；测定对照组、高胆固醇组、0.01%辛伐他汀组、0.1%BBR组和0.2%BBR组斑马鱼血清总胆固醇（TC）、总甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）的水平；RT-PCR检测肝脏HMGCR，LDLR和CYP7A1amRNA的表达水平；油红O染色检测肝脏中脂肪含量的变化。结果显示4%胆固醇喂养斑马鱼后血清TC水平升高且有时间依赖性，20d基本达到稳定水平；BBR组斑马鱼血清TC，TG和LDL-c水平显著下降，肝脏HMGCRmRNA的表达下降，LDLR和CYP7A1amRNA的表达升高，脂肪含量减少。4%胆固醇饲料喂养斑马鱼20d即可建立高脂斑马鱼模型，研究结果为进一步开展降脂药物的筛选奠定基础。 　　[关键词]斑马鱼；高脂血症；盐酸小檗碱；HMGCR；LDLR；CYP7A1a 　　随着人民生活水平的提高和饮食习惯的改变，心血管疾病的发病率逐年增加。高脂血症，尤其是血清总胆固醇（TC）水平的升高是引起心血管疾病的危险因素[1]。低密度脂蛋白（LDL）是血液中胆固醇的主要携带者，降低血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c），提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）的水平能明显减少冠心病（coronaryheartdisease，CHD）的发病率和死亡率[2-3]。因此研究开发降脂药物具有重要的临床意义。 　　降脂药物的筛选离不开高脂模型，目前适合选作高脂模型的动物包括大鼠、金黄地鼠和豚鼠等[4]。通过测定血清TC水平确定造模是否成功，但上述模型存在实验周期长，耗费高，操作繁琐，药物需要量大，不适用于高通量筛选等弊端。体外实验虽然周期短，简便快捷，成本低，但是实验结果无法代表药物在动物体内的效果。因此建立一种快速、高通量的动物模型用于降脂药物的筛选具有十分重要的意义。斑马鱼（zebrafish）是一种产于南亚的热带鱼，其器官和组织在结构和功能上与人类相似，基因序列与人类保持87%的相似性，研究表明斑马鱼与哺乳动物的脂质代谢类似，因其个体小，发育迅速，遗传背景清楚，实验周期短，近年来被广泛作为人类疾病模型来研究[5]。 　　小檗碱（berberine，BBR）是黄连Coptischinensis中的一种主要生物碱，研究发现小檗碱具有较强的降脂功能。本研究以血清TC，TG，LDL-c，HDL-c以及胆固醇合成、转运、转化相关基因，肝脏脂肪积累为指标，研究斑马鱼作为降脂药物筛选模型的可行性以及盐酸小檗碱对高脂斑马鱼脂代谢的影响，为开发新的降脂药物奠定基础。 　　1材料 　　1.1药品与试剂盐酸小檗碱（纯度98%，成都曼斯特生物科技有限公司，批号130213）；辛伐他汀（杭州默沙东制药有限公司，批号121064）；总胆固醇（TC，批号2014040）、总甘油三酯（TG，批号2014023）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c，批号2014027）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c，批号2014027）测定试剂盒（长春汇力生物技术限公司）；斑马鱼成鱼饲料（邰港科技股份有限公司，粗蛋白质46.8%，脂肪5.2%）；PCR相关试剂购于宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 　　1.2动物野生型斑马鱼由本实验室提供，养殖和繁殖参照Zebrafishbook[6]，水温28℃，pH7.0，14h光照，10h黑暗。 　　1.3仪器荧光显微镜（NikonEclipseCi）；体式显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；冰冻切片机（LeicaCM1900）；荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）；BioTekELX808酶标仪（基因有限公司）。 　　2方法 　　2.1饲料高胆固醇饲料的配制：将胆固醇与普通饲料（NC）溶解在无水乙醚中，充分搅拌至乙醚挥发，制备成含4%胆固醇饲料（HCD）。药物饲料的配制：在HCD中分别添加0.01%辛伐他汀、0.1%BBR和0.2%BBR，混合均匀制成药物饲料。 　　2.2动物分组3月龄斑马鱼随机分为对照组（NC）、高胆固醇组（HCD）、辛伐他汀组（SIM）、0.1%BBR组（BBR-L）和0.2%BBR组（BBR-H），每组25条，每天每条鱼投料15mg，每天喂食3次，且喂食前关闭循环水，记录每组斑马鱼吃完饲料所用时间。NC组和HCD组于0，2，4，8，14，20，25，30d随机各取3条采血测血清TC的含量。 　　2.3血清TC，TG，LDL-c，HDL-c分析斑马鱼禁食过夜，用0.02