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基因工程的有力工具—酶 基因工程中常用的工具酶 第二章 基因工程工具酶 第—节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 修饰酶 第五节 核酸酶 第一节 限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素 1、宿主的限制和修饰现象  1、宿主的限制和修饰现象 寄主细胞控制的限制与修饰（R/M体系） 宿主控制限制 在大肠杆菌K菌株上生长的λ噬体则表示为λ（K）。实验表明，用这种λ（K）噬菌体感染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑的效率就很低，因此我们说λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。 宿主控制修饰 在这些稀有的由λ（B）形成的噬菌斑中的噬菌群体，则已经发生了某些变化。用这些变化了的λ（B）噬菌体再感染B菌株，它们就可以在B菌株上有效地生长。如此由第二个寄主菌株（大肠杆菌B株）赋予λ噬菌体的这种非遗传化，使得它再感染时能够有效地生长，而没有再次受到限制的现象，称之为修饰。 无论是限制还是修饰，都是由寄主控制的，我们统称为寄主控制的限制与修饰现象。 1.1 限制（Restriction） 宿主DNA中的特定序列被甲基化，无法被自身的限制酶切割分解，而无甲基化的外源DNA将被宿主的限制酶摧毀，即限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 1.2 修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割 ① Dam甲基化酶 ② Dcm甲基化酶 1.3 限制与修饰现象意义 几乎所有的限制性内切酶都要和能识别而且甲基化相同的DNA位点的甲基化酶共同作用。这两个酶——限制性内切酶和甲基化酶一起称为限制—修饰系统(R-M系统) 。在甲基化后，DNA位点被保护起来，所以宿主细胞中甲基化的DNA能够不被限制性内切核酸酶消化。 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，它存在有两方面的作用。 保护自身的DNA不受限制 破坏外源DNA使之迅速降解 第一节 限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素 2 限制性核酸内切酶的类型 2.1 限制性核酸内切酶的概念 限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）:是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。 2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。 2.2 限制性核酸内切酶的分类 2.2.1 Ⅰ型限制性酶 最早(1968)发现的一种复合功能酶，具修饰和切割DNA两种特性。 该酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功能，并在切割DNA的同时或以后转变为ATP酶；如果位点上只有一条链被甲基化，则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点两条链均已甲基化，就与位点解离。 它的显著特点：是能识别DNA分子中特定的核苷酸序列，但切割作用却是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特异片段。因此，I型限制性核酸内切酶在基因操作中没有实用价值。 2.2.2 Ⅱ型限制性酶 1970从流感嗜血杆菌分离出 特点是只有一种多肽，它与甲基化酶是分开的两种蛋白质。 Ⅱ型限制性核酸内切酶仅需要Mg2+，可识别双链DNA分子上的特定序列，并且其切割位点与识别位点重叠或靠近，产生具有一定长度的DNA片段，因此在基因克隆中广泛使用。以下所称的限制酶均指Ⅱ型限制性核酸内切酶。 2.2.3 Ⅲ 型限制性酶 Ⅲ型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限制与修饰双重作用。其中M亚基负责位点的识别与修饰，R亚基具有核酸内切酶活性； 酶的切割作用需要ATP、 Mg2+和S—腺苷甲硫氨酸等辅助因子。其修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争，修饰位点在识别序列内，切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同。 在基因克隆中很少使用Ⅲ型限制性核酸内切酶。 三类限制性核酸内切酶比较 第一节 限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性