用同源重組的方法进行基因修复毕业专业论文.docxVIP

北京电子科技职业学院 Beijing Electronic Science and Technology Vocational College 毕 业 论 文 设计题目 用同源重组的方法进行基因修复 系 部 生物技术系 专 业 生物技术及应用 班 级 12生物(1) 姓 名 高亚平 指导教师 李晔 2015 年 6 月 目录 摘要 i Abstract ii 第一章 同源重组技术的研究进展 1 1 前言 1 1.1 微生物育种技术概述 1 1.2 同源重组技术发展 2 1.3 Red同源重组技术 3 1.4 CRISPR介导基因的编辑技术 4 第二章 质粒ptarget的构建 8 1 材料 8 1.1菌株和质粒 8 1.2培养基与常用溶液 8 1.4克隆中所用到的引物 9 1.5 仪器 9 2 方法 9 2.1 PCR反应体系与反应条件 10 2.2凝胶回收 10 2.3 gibson 11 2.4 将质粒Ptarget导入DH5α中 11 2.5 ptarget中N20的测序 12 2.6 ptarget质粒提取 12 3 结果分析 12 3.1 ptarget质粒的构建 12 3.2 N20测序对比 13 4讨论 14 第三章 基因组片段的获取与验证 15 1 材料 15 1.1 菌株和质粒 15 1.2 引物 15 1.3 大肠杆菌培养基 16 1.4 仪器 16 2 方法 16 2.1细菌基因组的分离 17 2.2 PCR反应体系与反应条件 18 2.3 DNA片段的回收与纯化 19 2.4 T克隆的反应体系与反应条件 19 2.5 化学转化 20 2.6 T—clone vector的菌落验证PCR反应体系与反应条件 20 3 结论与分析 20 3.1 mu-BL21基因组DNAtyrA、tnaB、talB、gabD、gabT基因的验证 20 4讨论 21 第四章 基因同源重组 22 1材料 22 1.1 菌体和质粒 22 1.2培养基与常用溶液 22 1.2.2常用溶液与试剂 23 1.3引物 23 1.4 仪器 23 2 方法 24 2.1 wt-BL21感受态的制备 24 2.2 cas9质粒的电转化 24 2.3 wt-BL21/cas9感受态的制备 24 2.4 各基因片段的同源重组 25 2.5 重组验证菌落PCR的反应体系与反应条件 25 2.6 同源重组成功的单克隆的获取 26 2.7 Ptarget和cas9质粒的去除 28 3 结果与分析 28 4．讨论 29 第五章 回补基因对菌体生长和色氨酸生产的影响 30 1 材料 30 1.1菌种和质粒 30 2 方法 30 2.1 RBS8质粒的扩增 30 2.2 mut-B8/mut-RBS8中mut-RBS8质粒的剔除 31 2.3 BL21、mut-B8、wt-B8、 holo-B8感受态的制备 31 2.4 RBS8质粒的电转化 31 2.5校正曲线制作 31 2.6 wt-BL8、holo-BL8和BL21 生长曲线的对比 31 2.7 色氨酸含量的测定 32 3 结果分析 32 4讨论 35 参考文献 36 致谢 37 摘要 诱变育种是工业上获得性能优良的菌株的必要手段，但是在对表达载体进行生物诱变时，就会不可避免的造成工程菌本身染色体的变异，为研究这些染色体的变异对工程菌本身的影响，本实验使用同源重组技术对通过artp诱导突变的BL8（BL21表达菌敲出3个基因后的工程菌）工程菌进行基因替换,并以色氨酸定位研究对象，观察其产率上变化，对其突变碱基对色氨酸的产量的影响进行了初步研究。 同源重组是基因工程实验中常用的技术手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用，而red（一种能够应用于大肠杆菌的基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统）同源重组技术是利用red系统是一项可在染色体水平进行遗传操作的技术，只需要较短的同源序列而不需要特定的限制性酶切位点，即可完成。 本课题以CRISPR为基本方法，采用同源重组技术利用cas9、ptarget两种质粒将突变型BL8菌的tnaB、talB、tyrA、gabD、gabT、lplA、aroF这些基因组基因片段替换到野生型BL8菌中。得到重组后的BL21野生菌后，首先进行了重组菌与突变菌生长曲线的对比，而后又进行了色氨酸产量的定量分析。最终发现重组菌与突变菌B8以及BL21的生长曲线并没有比较明显的差异，而最后lplA，talB色氨酸产量高于野生型B8菌低于突变型B8菌，表明lplA与talB的突变碱基对色氨酸的合成有促进作用。 关