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HPLC分析实验 色谱分析实验 ——原理及应用技术 实验目的 通过实验，学习色谱分析的基本原理及仪器的基本使用方法，了解计算机联机处理分析数据的过程。 了解并学会色谱定量方法，比较不同方法的优缺点。 色谱过程：在有互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配的过程。 由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离。 色谱分析法的实质：不同溶质分子由于结构的不同而与流动相及固定相的相互作用力不同，从而引起在色谱柱内运行过程中作用机理的差异。经过柱内多次作用的叠加后在宏观上引起其在柱内停留时间（保留时间）的差异，形成事实上的分离。 分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相? 本实验分离机理：咖啡因和苯甲酸的结构不同， 流动相:缓冲液:甲醇=60%:40% 缓冲液: pH=3.0 or pH=4.5? 化合物在不同酸度介质中有不同的解离度，使其在色谱分离过程中的作用有区别 原则:分离度(R1.5)及分析时间(越短越好) 结论:选择pH=4.5缓冲溶液 拓展: 流动相:缓冲液:甲醇=40%:60% 咖啡因和苯甲酸的出峰提前, 液相色谱分析中，因分子中的共轭大π电子的能级跃迁在紫外区有明显吸收，可以利用紫外检测器进行检测。 用标准物比对法定性：特定组分在同色谱条件下有不变的保留值(时间、体积等)，可将之与已知纯物质的相应保留值作比对的方法进行定性分析。 用外标法定量：以不同量标准样品进样得到峰面积，然后作图得标准曲线，求出回归方程，得到相关系数。然后进样得到被测试样的峰面积从曲线中查到含量， 方法适用于样品复杂，但只对部分组分感兴趣时。 液相色谱中，因不同组分在紫外区的最大吸收波长不同，同样量的不同组分在固定波长测定时其吸光度不同，需要校正。 用外标法时相当于进行了校正。 DAD谱图：根据DAD数据，可以确认检测波长有两处：230nm和275nm。一般可选后者，但当背景干扰大时需选275nm。 所用仪器 HP-1100液相色谱仪配置： 注射器 液相色谱手动进样器 实验步骤——液相色谱 按甲醇∶缓冲溶液(pH=3和pH=4.5两种)= 40:60 配好流动相，经超声脱气并过滤。 打开计算机启动“bootp”文件，然后打开仪器电源建立计算机和仪器的连接。启动工作站，调整好流动相流量和检测波长，等待基线平直。 条件试验拓展 实验结果的影响因素很多，其中实验条件的优化就涉及固定相种类、流动相种类及配比、pH值、流速等。部分结果为： 实验步骤——液相色谱 计算未知试样中咖啡因和苯甲酸的百分含量。 进行柱性能的评价。 相关公式 塔板数及板高： 分离度： 数据处理 思考题 根据实验数据，探讨气相色谱和液相色谱法中定量分析方法不同的原因。 探讨高效液相色谱分析法的应用价值。 所用的检测器是否适用于检测所有的有机化合物？为什么？ 若实验获得的色谱峰面积太小，应如何改善实验条件？ 为什么液相色谱多在室温下进行分离检测而气相色谱法相对要在较高的柱温下操作？ * 基本分离原理 基本分离原理 基本分离原理 咖啡因 苯甲酸 疏水性: 小 大 保留时间: 小 大 出峰: 先 后 分离柱: C8或C18 基本检测原理 二极管阵列检测器光路图 二极管阵列检测器色谱图 定性定量分析的原理 定性定量分析的原理 校正因子及测定 检测波长的选择 四元梯度高压泵 C8ODS色谱柱 手动进样器 可变波长紫外检测器 色谱工作站 气相色谱注射器的针头为尖，液相色谱的注射器针头为平，两者不能混用。 取样时，流动相直接进柱，进样口与定量管连接，样品充满定量管后，多余样品从6流出。 进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部携带进入色谱柱分析。 在两个pH（3.0和4.5）条件下分别取10μL混合标样进样，选择合适体系 前期准备 条件试验 5.77 10.14 8.47 4.73 1.25 0.73 分离度 R 8.647 5.114 3.153 2.019 1.571 1.345 苯甲酸 tR 6.573 2.694 1.919 1.496 1.349 1.281 咖啡因 tR 30% 40% 50% 60% 70% 80% 甲醇比例 配比变化(pH = 4.5, 1.5mL/min) 流速变化(pH = 4.5, 40：60) 7.34 7.15 10.14 9.78 分离度 R 1.895 2.363 5.114 7.