第八章基因工程與體外表達.ppt.ppt

杆状病毒表达系统利用一种不依赖于辅助病毒的病毒,该病毒可在适于悬浮培养的昆虫细胞中增殖至高滴度,能获得大量的重组蛋白,大部分超量表达的蛋白质为可溶性蛋白.杆状病毒对脊椎动物无感染性。 第五节 基因的改造 (一 )寡核苷酸介导的定点诱变法的建立 （二）含U模板法 （三）PCR定点诱变法 寡核苷酸介导的 诱变方法的基本原理： 含U模板法 PCR介导的 定点诱变法 第六节 克隆基因的表达 ? 基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。 真核生物结构基因示意图 真核生物基因的结构特点 原核生物基因的结构特点 基因是连续的, 无内含子 一、大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达外源基因的优势 繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定 大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 如糖基化或磷酸化等修饰作用 2. 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白, 造成表达产物不稳定 （一）基因表达的基本要素 1．目的基因和密码子 (1)目的基因 目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA 。 cDNA的始密码子（ATG）上游部分（5ˊ端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。 (2)密码子 生物体对密码子的偏爱性 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 2．载体的选择 所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。 3．目的基因与载体的连接 （1）利用合适的接头进行连接引入ATG （2）融合蛋白 融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。有些载体的SD序列后面带有一段大肠杆菌蛋白质的结构基因，此结构基因的3ˊ端为多克隆位点，便于目的基因插入，经转录和翻译之后，即产生融合蛋白。 表达融合蛋白的优点 (1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。 (2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。 (3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。 (4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。 (5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。 4．受体菌株和诱导条件 (1)根据载体所携带的启动子选择特定的菌株 (2)诱导表达 λgt10和λgt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。 λ gt11为表达型载体。 λZiplox载体 三、粘性质粒（cosmid） 粘性质粒是由λ噬菌体的噬菌体的粘性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50kb。 四、M13噬菌体 M13噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 五、病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。 第三节 基因克隆的基本过程 ? 基因克隆主要分为以下几个步骤： ①制备目的基因和相关载体； ②将目的基因和有关载体进行连接； ③将重组的DNA导入受体细胞； ④DNA重组体的筛选和鉴定； ⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究。 一、? 目的基因的获得 （一）从基因组文库中获得 （二）从cDNA文库中获得 （三）用聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增有关DNA片段 （四）人工合成 二.载体的选择 三、DNA分子的体外连接 （一）粘性末端 （二）人工接头的使用 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接 （一）粘性末端 定向克隆 （二）人工接头 （二）人工接头 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接 四、外源DNA导入宿主细胞 将重组DNA或其他外源DNA导入