00生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-离心技术.docVIP

离心技术 一、离心技术的基本原理 　　离心技术是实验室常采用的技术，主要是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法。 　　被分离液体中的可沉淀微粒，在重力和浮力相互作用下所受到的下沉力有如下的关系式： 　F ＝重力－浮力＝ VPg － Vδg ＝ Vg （ p － δ ） 　式中， F —— 下沉力； 　V —— 微粒体积； 　P —— 微粒密度； 　δ —— 介质密度； 　g —— 重力加速度。 　　当 P ＞ δ 时，微粒下沉； P 与 δ 差值越大，微粒下沉速度越快。因此，加大离心机转速可加快离心微粒的沉降速度。 二、制备性离心技术的基本原理 　　制备离心技术是以分离、纯化、制备某一生物分子、亚细胞粒子、细胞器和细胞为目的的离心技术。根据原理不同，制备性离心技术可分为差速离心技术和密度梯度离心技术两大类。 　　差速离心技术是指根据悬浮液中颗粒的不均一性，不同颗粒有着不同的沉降速度，通常颗粒大的沉降速度快。为了将各不均一的颗粒组分分开，可以选用不同的离心速度，即可由低速到高速分阶段进行离心，或采用高速与低速交替反复离心，这样可使沉降速度不同的颗粒在不同的离心速度和不同的离心时间下分批沉降析出，同时得到所需要的成分。 　　密度梯度离心技术是指事先在离心管中放入不同密度的离心介质，离心管从上至下，介质密度由低到高，形成一个具有密度梯度的离心介质。介质的最大密度需小于样品中最小颗粒的密度，这样就保证了样品中所有颗粒沉降速度大于零。加样品于密度梯度离心介质上，在离心过程中，颗粒或向下沉降、或向上浮起，沿梯度移动，直至与它密度相等的位置形成区带。处于等密度处的颗粒，由于溶于密度梯度介质中而没有重量，不再沉浮。不同颗粒的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大分离效果越好。区带的形状、位置均不受离心时间的影响。 三、离心机的分类 　（一）根据转速 分类 　　1 ．常速离心机 　　指转速少于 5 000r/min 的离心机，主要用于一般液体中可沉淀颗粒的分离，或者制备一般的组织匀浆。 　　2 ．高速离心机 　　指转速在 5 000 ～ 25 000r/min 之间的离心机，主要用于细胞器的分离和生物大分子的制备。 　　3 ．超速离心机 　　指转速超过 25 000r/min 的离心机，多用于亚细胞结构的分离和生物大分子的制备。目前超速离心机的转速可达 85 000r/min 以上。生物大分子在超速离心力场的作用下，离心力大于分子的扩散力，生物分子便逐渐下沉，其沉降的速度随着生物大分子的分子量和形状的不同而不同，从而使不同的生物大分子彼此分离。 　（二）根据温度 分类 　　1 ．常温离心机 　　指在室温（ 25 ℃ ）下进行离心的离心机。一般常速离心时，使用常温离心机。 　　2 ．低温离心机 　　指在 4 ℃ 下进行离心的离心机。一般高速离心时，使用低温离心机。 　　3 ．冷冻离心机 　　指在 0 ～－ 25 ℃ 下进行离心的离心机。一般超速离心时，使用冷冻离心机。 　（三）根据体积大小和放置方式 分类 　　1 ．台式离心机 　　体积小，放在操作台上，操作方便，用于微量物质的提取。 　　2 ．落地式离心机 　　体积大，放在地面上，用于大量物质的提取。 　　3 ．悬吊式离心机 　　体积小，悬吊在空中，早期使用的离心机，已被淘汰。 　（四）根据供能方式 分类 　　1 ．自动式离心机 　　由操作者接通电源、设置程序，电脑程序控制离心速度和时间的离心机。 　　2 ．电动式离心机 　　由操作者接通电源、利用旋钮控制离心速度和时间的离心机。 　　3 ．手动式离心机 　　由操作者利用齿轮原理，直接控制离心速度和时间的离心机。早期使用的离心机，已被淘汰。 四、电动式离心机的使用方法 　（一）离心前的准备 　　1 ．检查离心机上的变速旋钮是否在 “ 0” 处，离心外套管底部是否有橡皮垫并完好。 　　2 ．将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量占离心管的 2/3 体积。盛量不宜过多，以免溢出。再将此离心管放入离心套管。 　　3 ．将一对装有离心管的离心套管放在台称上称量平衡。如不平衡，可调整离心管内容物的量或向离心套管中加水进行平衡。 　（二）离心机的操作 　　1 ．将平衡好的套管按对称方向放入离心机的孔中，并取出不使用的离心套管，盖上离心机盖。 　　2 ．接通电源，按顺时针方向旋转时间旋钮至所需离心时间刻度处。慢慢旋转速度旋钮，使转速逐渐加快到所需转速。 　　3 ．离心完毕，按逆时针方向慢慢旋转速度旋钮至 “ 0” 处，待离心机自动停止后，打开离心机盖并取出样品管。 　　4 ．将离心套管中的橡皮垫洗净并保管好