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白血病分子生物学 白血病分子生物学 白血病的分子机制 白血病的分子检测 白血病分子检测的临床应用 白血病的分子机制 基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。 癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。 癌基因活化的方式： 点突变 染色体重排 基因扩增 抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。 白血病的分子机制 白血病的分子机制 增殖过度 分化阻断 凋亡受抑 “二次打击”学说 D.Gary Gilliland Best Practice Research Clinical Haematology.2003;16:409-417 白血病的分子检测 Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 测序 芯片 白血病的分子检测 PCR反应原理 N = N0 x (1+E)n N：扩增子数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 n：循环数 白血病的分子检测 PCR理论方程 白血病的分子检测 PCR方法优点 快速 灵敏 特异 PCR方法缺点 假阳性 假阴性 白血病的分子检测 PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。 RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。 巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。 RQ-PCR：可定量扩增产物。 白血病的分子检测 RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化 TaqMan探针法 特异性高 多重基因定量 成本较高 SYBR Green I 法 成本低 最适合初步筛查 熔解曲线功能 无法多重检测 无模板特异性 灵敏度低 白血病的分子检测 CT值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数 CT值与起始模板量成反比 白血病的分子检测 RQ-PCR的检测系统： 该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实时检测的目的。 系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到CT值。 该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。 白血病的分子检测 RQ-PCR方法优点： 灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定 RQ-PCR的操作流程 从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT-PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上 纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品） 构建标准曲线（CT υ lgcopy） 样品的定量检测 校正样品基因拷贝数 白血病分子检测的临床应用 白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义： 补充MIC检查的不足 发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（MRD） 为研究白血病的发病机制打下基础 白血病分子检测的临床应用 PCR方法检测MRD常用的分子标志 AML1-ETO t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他AML亚型（M3除外）好 AML1-ETO 对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况 RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水平。连续定量AML1-ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗