发酵法生产明质酸.doc

发酵法生产透明质酸 透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。 透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。 微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂．并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。 发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。 一.发酵部分： 经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块： 1.菌种的筛选 2.菌种的诱变 3.培养基配方的优化 4.菌株的最佳培养条件 首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。 下面我将针对这几个模块分别做详细的叙述与分析。 1. 菌种的筛选： 优良的微生物菌种是发酵工业的基础，得到这类产物的两个成功要素在于产生菌的选择和筛选方案的确定。以目的代谢物透明质酸为目标筛选出能产生它的菌种是前提，设计出科学合理的筛选方案是事关筛选工作成败的关键。菌种初筛方法必须快捷、简便、有效，才能一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰掉，把少量有用的微生物筛选分离出来。经研究发现在牛鼻粘膜上分离到的HA产生菌种即乙型溶血性链球菌比较适合用来发酵。 1.1筛选步骤： 牛鼻粘膜--稀释分离涂平板--初筛菌株--复筛摇瓶发酵--发酵液离心--上清液乙醇沉淀--定性分析--获得目的菌株--斜面培养 1.2 菌种筛选操作方法： 1.2.1 初筛： 将牛鼻黏膜用0．1％蛋白胨溶液分成梯度涂于血琼脂平板，37℃，培养24h。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态，用接种针挑起看其黏度。荚膜染色并镜检。 1.2.2 荚膜染色 抹片自然干燥，甲醇固定，以久贮的多色性美蓝液做简单染色。荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。菌落选择的依据：产生HA的菌落透明度很高，隆起，呈水滴状色泽近似蛋清。 1.2.3 复筛 发酵摇瓶中接人初筛疑似菌株，每株五瓶，在200 r/min、37℃下培养24h。取复筛发酵液100ml，离心4000 r/min，20min。上清液用三倍体积无水乙醇沉淀。沉淀物用红外吸收光谱作定性分析。 1.2.4 红外吸收光谱法 取HA 2mg，KBr压片，用IR一400红外分光光度计在4000—5000m-1范围内扫描。 发酵液提取物的红外吸收图谱在3400 cm-1附近有强的OH伸缩振动的特征吸收，表明有多羟基结构；在2900 cm-1附近有CH2的伸缩振动，1620cm-1及1560cm-1附近有CO、CN的伸缩振动，表明存在着乙酰氨基结构；在1400cm-1和1320cm-1附近有COC的伸缩振动和OH的弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上解离羧基结构和多糖羟基结构。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的HA红外吸收图谱。 1.2.5 测定 通过测定各种物质的含量来判断筛选结果是否正确。 (1)HA中葡萄糖醛酸含量的测定。参照硫酸-