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分子生物学实验Experiments of molecular biology 一、 教学目的 《分子生物学实验》课程主要从提取和分析遗传物质和基因为基础，从DNA的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等过程设计了一系列基础实验，形成一个涵盖现代分子生物学基础实验内容的实验课程教学体系，包括现代分子生物学基本技术方法，帮助学生巩固有关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的基本实验方法、技术和操作技能。 二、 教学要求 通过学习使学生对所有实验内容有一个整体的了解； 熟悉分子生物学实验技术（包括DNA技术、RNA技术、蛋白质技术、杂交技术等）的基本原理方法，掌握DNA提取纯化,定量, DNA克隆, 电泳等基本实验技术，重点掌握质粒DNA纯化技术, 酶切技术, DNA片段回收,重组连接技术, 电泳技术, 转化技术, 基本PCR技术以及蛋白质的诱导表达技术等； 要求学生分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理； 学习仪器设备的使用 分子生物学实验室要求 穿实验服进入实验室； 保持实验室安静； 保持实验室清洁干净和实验台面整洁； 实验前要预习实验教材； 不准穿拖鞋进入实验室； 不准在实验室吃东西、喝水； 要求刷卡进入实验室； ??? 实验一核酸的提取（质粒DNA的提取和纯化） 【目的要求】 1．学习载体的基本结构 2．了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设计思想； 3．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术； 【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 【实验材料和用品】 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pET-29a质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶 【实验步骤】 1. Pick single colony and inoculate 5 ml of LB broth containing 200 g/l Ampicillin or 1mg/5ml with a loosened cap and a piece of tape to hold it in place. Shake at 250 RPM 37oC overnight. 2. Centrifuge 1.5mL cells in 1.5 mL Eppendorf tube at top speed for 1 minute. Discard supernatant.? 3. Resuspend cell pellet in 100 ul of GTE buffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8).? Vortex gently if necessary. 4. Add 100 ul of NaOH and SDS lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) respectively. Invert tube 6-8 times. 5. IMMEDIATELY add 150 ul of 5 M potassium acetate solution (pH 4.8). This solution neutralizes NaOH in the previous lysis step while precipitating the genomic DNA and SDS in an insoluble white precipitate. Spin at top speed 1 min. 6. Transfer supernatant to new tube, being careful not to pick up any white flakes.? Precipitate the nucleic acids with 0.5mL of isopropanol on ice for 10 minutes and centrifuge at top speed for 1 minute.