木聚糖酶测定的有关问题.docVIP

饲料用木聚糖酶活力测定的研究 文章来源：农业部饲料工业中心　作者：陆文清等　更新时间：2011-03-30 　　饲料用木聚糖酶的分析测定是长期以来困扰木聚糖酶生产和应用的一个主要难题,特别是固态发酵生产的木聚糖酶,发酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和甘露聚糖酶等)[1-3]。文献报道的关于影响酶活测定的因素很多,测定的重复性较差 [4-5，7]，除了温度和pH值以外,还存在着其它很多不确定的因素。本文将从底物的性质和浓度、酶样的稀释度、离子强度和反应时间等方面讨论对酶活测定的影响,提出比较可行的饲料用木聚糖酶的分析方法。 　　酶活定义为在37 ℃和设定pH值条件下，每分钟内从底物溶液中降解释放1 μmol/l还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)。测定木聚糖酶活力的方法主要有3种：粘度法、底物染色法和还原糖法。 　　粘度法是通过测定木聚糖酶对底物粘度的降解速度来计算酶活力，这种测定分析方法有较好的实用价值，但是测定过程比较繁琐，而且重复性较差，目前很少采用。 　　底物染色法是一种比较简便快速的测定方法,其基本原理是以木聚糖为基质,用胶联方式连接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡,质量稳定的片剂。这种片剂容易溶于水溶液中,与木聚糖酶反应后,长链的木聚糖被降解,结合的染料分子被释放到溶液中。通过测定溶液中染料的浓度,就可以就算出酶活力。这种测定方法经常被一些专业生产生物酶的大型企业采用。但是它只能测定特定的木聚糖酶活力,不具有代表性。 　　还原糖法是通过测定还原糖的产量来计算酶活力。这种分析方法也比较简便，而且重复性也比较好。国内外关于木聚糖酶的研究报告多数采用这种方法。这种方法的主要不足是不能很好地分析内切酶的活力，而内切酶的活力对于饲料酶的实际使用效果来说是很重要的。 　　如果希望通过测定木聚糖酶在某一标准状态下的活力来判断木聚糖酶质量的优劣或者预测其动物饲喂效果是远远不够的。木聚糖酶的实际作用底物是不溶于水的高聚物，它们主要存在于植物种子的表皮层内，与葡聚糖、果胶、甘露聚糖、木质素和蛋白质等生物大分子结合在一起。在天然木聚糖与水组成的多相体系中，酶总是处于底物不饱和状态，因此难以用测定酶反应初速度的方法测定酶活力。酶与底物的反应是在固相界面上进行的，其酶解反应速率受到底物对酶蛋白吸附速率和产物扩散速率的限制[4]。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖，如燕麦木聚糖和桦木木聚糖，其测定值要比实际发挥作用的酶活力高出很多倍[5-6]。从目前的研究进展分析，制定一个绝对公平的标准是很困难的，几乎是不可能的。 　　2005年6月，我们接受全国饲料工业标准技术委员会下达的木聚糖酶活力测定的标准制定任务，联合了众多酶制剂企业共同起草了木聚糖酶活力测定的标准。在标准起草过程中，我们分析了近300 个含有木聚糖酶的样品，测定数据约1 200个。通过综合各种因素，采用还原糖法，分析了影响酶活力测定值的因素，同时结合生产实际，制定了相对比较公正科学的评判标准。 　　1 重要操作分析参数的确定 　　1.1 标准曲线的线性范围 　　确定酶解产物浓度与吸光度的标准曲线的线性范围是酶活力测定的前提，试验采用DNS法测定木糖浓度，其线性范围为：木糖浓度在0.2～0.7 mg/ml之间，吸光度在0.15～0.70之间 　　1.2 底物的性质 　　从酶的组成分析可以发现，木聚糖酶存在着底物作用的特异性。 　　目前工业生产中使用的木聚糖酶主要有两大类，一类是用于饲料，另外一类是用于造纸。用于饲料的木聚糖酶应该以降解燕麦木聚糖的能力为主要检测指标，而用于造纸工业的木聚糖酶应该以降解桦木木聚糖为主要分析指标。 　　在实际使用过程中，单纯比较某一种酶活力指标是不够的，但是要想全面衡量饲用木聚糖酶的活性和使用效果也是很困难的。目前国内外的研究报道通常以降解燕麦木聚糖(Sigma X0627)的活力作为主要比较指标[8-10]，这是因为测定降解燕麦木聚糖相对比较容易，重复性也比较好。因此笔者建议测定饲料用木聚糖酶活力的行业标准也以测定降解燕麦木聚糖的活力为主要指标。 　　从理论上分析，只要满足3个条件，即能被酶作用、很好的代表性、很好的稳定性和重复性，都可以作为测定饲料酶活力的底物。但是，从目前的研究分析发现，能符合这个条件的底物只有Sigma X0627，虽然Sigma X0627这个产品的本意并不是想用于木聚糖酶活力测定的标准底物。无论是国内还是国外，也不论是生产实际还是SCI论文，涉及木聚糖酶活力测定的底物基本上都是用Sigma X0627。 　　1.3 底物浓度对测定活力的影响 　　底物浓度对测定值有重要影响，这主要与酶反应的米氏常数Km值有关。图2是关于3种菌种产生的木聚糖酶，它们要求的饱和底物作用浓度(使酶活发挥达到99%的饱和活力