17Northern杂交与斑点杂交解剖.pptVIP

第17讲;温故知新;一、Northern杂交的由来 二、Northern杂交的用途 三、Northern杂交的基本流程 四、Northern杂交的优点和缺点 五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂交的区别 六、斑点印迹杂交的原理 七、斑点印迹杂交的基本流程 八、课堂小结 九、作业 ; Northern杂交由斯坦福大学的George Stark教授于1975年发明。其原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 之所以命名为Northern杂交是因为其原理与Edwin Mellor Southern教授发明的southern杂交原理相似，实验过程也相似，所以取了一个类似的名字叫Northern杂交。 ;二、Northern杂交的用途;三、Northern杂交的基本流程;三、Northern杂交的基本流程;1、RNA的提取 一个标准的印迹程序，第一步是提取样本的总RNA，在通过挂有oligo(dT)的色谱柱通过亲和???析分离纯化总RNA中的ｍＲＮＡ。然后通过甲醛变性胶将ｍＲＮＡ进一步按大小分离开。并通过溴化乙啶（ＥＢ）染色在转印前来检查ＲＮＡ的质量。 也可以使用含有尿素的的聚丙烯酰胺胶在分离已经片段化的ＲＮＡ和小ＲＮＡ。在跑电泳时可加入ＲＮＡｍａｒｋｅｒ以方便对ＲＮＡ大小的观察。 当然，在总RNA样品中，核糖体亚基也可以充当marker的功能（28s的条带相当于5kb，而18s相当于2kb）。 ;三、Northern杂交的基本流程;2、转膜 Northern杂交所用的是尼龙膜带有正电荷，对带有负电性核酸具有高亲和性。在转膜时使用的转膜缓冲液里面含有甲酰胺，甲酰胺可以降低杂交时RNA的退火温度以防止由于高温而产生的RNA的降解。在热和紫外线的作用下，RNA于尼龙膜间形成了共价键，从而被固定住。当探针与之结合时，特定的RNA就在膜上被标记了下来。 ;三、Northern杂交的基本流程;3、杂交 Northern杂交可以选用放射性同位素标记或地高辛（DIG）和生物素（BIOTIN）标记的RNA探针或DNA探针。 RNA探针具有显示更强的杂交信号和更低的非特异性背景的优点，因此只要可能， George Stark可尽量选用RNA探针。 但由于RNA的不稳定性，RNA探针在操作上的要求和难度要比使用DNA探针高很多，因此大多数研究者仍使用DNA探针。;;四、Northern杂交的优点与缺点 ;1、微阵列技术优于northern基因的地方主要是它可以大通量的同时检测数千个基因，这是northern杂交所做不到的。 2、在试验中大量用到有毒有害的试剂包括：DEPC、甲醛、EB、紫外线、放射性同位素等。对于研究人员具有很大的危害。 3、Northern blot的操作步骤相当繁琐，且对RNase污染非常敏感，任一步操作不当都会严重影响实验结果。 ;五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂交的区别;五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂交的区别;1、原理不同 Western杂交的原理：先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。 ;五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂交的区别;五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂交的区别;六、斑点印迹杂交;根据膜上所点的核酸样品的种类不同;如果用特殊的狭缝点样器点膜,得到的线状杂交信号比圆点状信号更有利于结果的判定和检测，这称为狭线印迹法或狭缝印迹法(slot blotting)。 斑点杂交主要用来检测细胞基因拷贝数的变化或者mRNA含量的变化。它的操作简便，提取的核酸不需经电泳和转印，直接点在支持膜上。;优点;七、斑点印迹杂交的基本流程;;;;八、课堂小结 九、作业