第十三章 高效液相色谱法幻灯片.pptVIP

第十三章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) ; 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 ;2．高效液相色谱法与气相色谱法 ; (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 ;13.2 高效液相色谱仪;液相色谱仪;流 程; ;动画演示;2．进样系统 ;动 画;3 分离系统——色谱柱 ;常用分离柱;4．检测系统 ; ;紫外可见光、电化学检测器的流通池???较;1.紫外检测器;1a.紫外光电二极管阵列检测器;;光电二极管阵列检测器;紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较;2. 荧光检测器（fluorescence detector）;3. 示差折光检测器（differential refractive index detector）;示差折光检测器光路; 13.3高效液相色谱的固定相和流动相 ;1.表面多孔型固定相;2．全多孔型固定相 ; ;（二）流动相;;（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～IOOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. ;13.4高效液相色谱法的主要类型及选择; ;化学键合固定相类型;化学键合固定相的特点;3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。 ;（二）化学键合相色谱法 （CBPC） ;2．键合固定相的制备 （l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应： ≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。 （2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相 制备反应如下 ; 共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内.;（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相 制备反应如下： ;3．反相健合相色谱法 ;;4.正相键合相色谱法 ;5.离子性键合相色谱法 ; ;（三）液一固吸附色谱法(LSAC); ;2．固定相 ;3流动相 ;;(四）离子交换色谱法（IEC） ;1．离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下： 阳离子交换： ;达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）： ; ;; ;3．流动相 ;（五）离子色谱法（IC） ;R+－OH＋H+Cl- -→R+－Cl十H2O R+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2．6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降