分子生物学实验 实验二 GDPH基因的PCR扩增.pptVIP

RT反应条件 42 ℃ 60min 85 ℃ 5min 4℃ forever SYBR Green I 工作原理 未结合的SYBR green I 结合解离曲线识别不同的PCR产物 95 ℃ 15sec; 60℃ 20sec; 95 ℃15sec 在60 ℃ ～95 ℃ 之间的Ramp time设为19:59 SYBR Green I的特点 可以用于不同的模板 使用方便，价格相对便宜 灵敏度很高 与非特异性产物结合 解离曲线 选择良好的引物和探针并优化反应条件 定量—— 绝对标准曲线方法 标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃ 假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数 在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线 更为简便省时，也是相当可靠的 定量—— 相对 Ct值方法 Expression of GPR30 in different prostate cells Effect of siRNA on the expression of GPR30 in 293T cells transfected with pGPR30-IRES2-EGFP plasmid 1. Control 2. anti GPR30 siRNA 3. Scramble siRNA 实验三 DNA胶回收 【操作步骤】 1.取50μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。 2.在紫外投射仪下判断DNA片段的位置，然后用干净的手术刀割下含有所要DNA的琼脂块. 3.称重，该重量为一个凝胶体积。琼脂块放入1.5ml离心管中。 4.加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，置于75℃水浴中加热，使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。 5.加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B,混合均匀。 6.将上述混合溶液转移到DNA制备柱中，室温放置2分钟。室温13000rpm离心1分钟，弃废液。 7. 将制备柱放入收集管中，加入500μl Buffer W1,13000rpm离心30秒，弃废液。 8.将制备柱放入收集管中，加700ul Buffer W2,13000rpm离心30秒，弃废液. 9.重复第8步。 10.让离心管盖开着，室温高速12 000rpm离心1分钟。 11.将离心柱放入一根新的1.5ml离心管中，在柱膜中央加30μl Elution Buffer 或水（pH＞7.0），室温或37 ℃放置2分钟。 12.13000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即含有回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。 * 產物的增加可以寫成功是 PCR EFFICIENCY扮演重要的角色 100%pcr產物的ˋ跟原始濃度成正比的關係 所以災ˋ這裡提供我們可以定量的訊息 精確定量的結果 * 加入帶有螢光標定的dna 激發螢光分ˇ子 位反映時不發光 * 7700: 6- 8 sec scan one plate 5700: 15 sec for one plate scan Probe Tm: 68 to 70 degree. Under this high temperature , Taq DNA polymerase need to cleave DNA when probe is not perfect match( ex: AD) Taq DNA polymerase just kick out the probe 试剂 原液浓度 工作浓度 50?l体系 PCR缓冲液 10? 1? 5?L 上游引物 10?mol/L 0.5?mol/L 2.5?L 下游引物 10?mol/L 0.5?mol/L 2.5?L dNTPs 2.5mmol/L 200?mol/L 4?L MgCl2 25mmol/L 1.5mmol/L 3?L DNA模板 0.1～10ng ddH2O 补足47.5?L Taq酶 1U/?L 2.5U/50?L体系 2. 5?L 2010.3.26日PCR试剂盒： 试剂 原液浓度 工作浓度 50?l体系 PCR试剂 2? 1? 25 ?L 含（Taq酶 0.1U/?L 2.5U/50?L体系 2.5