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用氯化钙化学转化 实验操作（转化） 取制备好的感受态细胞，置于冰浴上(50ul)； 向感受态细胞中加入5ul连接产物（不超过转化体系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min； 将连接体系放入42℃水浴中热激90sec；迅速转入冰浴2min； 加入0.4ml LB液体培养基，37℃振荡培养20min； 取适量培养物涂布于Kan+ LB固体培养基，放入37℃培养箱中培养。 HIGH-EFFICIENCY TRANSFORMATION BY ELECTROPORATION Electroporation with high voltage is currently the most efficient method for transforming E. coli with plasmid DNA. It routinely gives more than 10^9 bacterial transformants per microgram of input plasmid DNA. * * * * 实验六:目的基因的连接、转化 实验目的及背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。 载体和插入片段DNA的浓度测定 线性化载体和目的基因体外重组 感受态大肠杆菌的制备 重组子的转化 转化大肠杆菌的培养 本次课程的实验内容： Total 48,502bp 500 ng 19329/48502*500 ≈ 200 ng 7743/48502*500 ≈ 80 ng 6223/48502*500 ≈ 65 ng 4254/48502*500 ≈ 44 ng 3472/48502*500 ≈ 36 ng 2690/48502*500 ≈ 28 ng 1882/48502*500 ≈ 19 ng 1489/48502*500 ≈ 15 ng 925/48502*500 ≈ 10 ng 目的基因浓度测定—琼脂糖凝胶电泳法 质粒载体特点 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 质粒载体 1.pET-28a(+) sequence landmarks： T7 promoter 370-386 T7 transcription start 369 His?Tag coding sequence 270-287 T7?Tag coding sequence 207-239 Multiple cloning sites (BamH I - Xho I) 158-203 His?Tag coding sequence 140-157 T7 terminator 26-72 lacI coding sequence 773-1852 pBR322 origin 3286 Kan coding sequence 3995-4807 f1 origin 4903-5358 2.pET28a多克隆位点信息 Xho I(158) Not I(166) Eag I(166) Hind III(173) Sal I(179) Sac I(190) EcoR I(192) BamH I(198) Nhe I(231) Nde I(238) Nco I(296) 3.pet28a抗性是Kana。 4.pET28a启动子是T7，纯化标签是N-His，使用Ni柱纯化。 5.pET28a可以使用的表达菌株有BL21（DE3）系列的表达菌株，Rosetta和Coden Plus系列菌株，以及其他可以进行T7启动子表达的菌株都可以，使用非常广泛也行。 6.pET28a蛋白是融合表达蛋白，载体本身就自带了ATG启动子，只需要将自己的蛋白出入到相应的多克隆位点处即可进行蛋白表达，但是要注意插入位点的多克隆位点读码框的正确性，避免密码子移码突变。 2.ＤＮＡ分子的体外重组 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段相邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸二酯键的生物化学过程. 常用的DNA连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的DNA连接酶 (2)来自噬菌体的T4 DNA连接酶。 ＤＮＡ连接酶 DNA连接示意图 1.
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