分子生物学-张晓东-1常用的分子生物学内容和相关技术.docVIP

常用的分子生物学内容和相关技术 分子克隆（分子操作） 原核表达系统（PET28a，PET30a等） 融合蛋白 抗原 免疫动物 原核表达系统 蛋白转导系统（TAT） 2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染） 在培养的动物细胞中 分子克隆的方法： 选择合适的表达载体 选择酶切位点，设计PCR引物并合成 制备待克隆的靶基因 PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA） RT-PCR 质粒中已克隆的目的片段 人工合成cDNA片段 退火后形成双链 细胞培养 动物细胞 植物细胞 原代细胞培养 传代细胞培养 探讨功能： 与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义 内源基因：或使内源基因表达抑制（antisence，RNAi）或缺失、突变 外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上表达上调（up-regulation） 信号传导：protein-protein interaction Two hybrid system Western blot immunoprecipitation 免疫荧光双标记图像分析 检测表达 Protein （tissues or cells -Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium –ELISA） Reporter gene RT-PCR，Real-time PCR Gene chips: cDNA, MicroRNA Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells -in situ） BrdU, Flow Cytometry （cell cycle，apoptosis） 大肠杆菌中 大肠杆菌中