核酸的提取及含量的测定（ppt）.ppt

核酸的提取及含量测定 一、核酸提取 ㈠ 原理 ⒈ 破碎细胞： 匀浆、超声震荡、酶解等，因动物组织含有核酸酶，在一定温度下，该酶可被Ca2+,Mg2+等激活，为避免核酸酶对核酸的水解，与核酸提取液中加入适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离子，整个过程在低温下进行。 ㈡ 实验操作 * 核酸是具有重要生物化学功能的生物大分子，根据其分子所含糖的种类不同，核酸分为两大类，含核糖的称为核糖核酸(RNA)，含脱氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸(DNA)，DNA是遗传信息的携带者，与生物的生长、繁殖、遗传和变异有密切关系，RNA参与蛋白质的生物过程，由于核酸具有如此重要的生物学功能，对核酸的结果与功能的研究已成为当前生物科学的重要课题之一。 ⒉ 提取核糖核蛋白(RNP) 在生物体内核酸多以核蛋白的形式存在于组织中，根据核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)在不同浓度电解质溶液中溶解度明显差别进行分离。故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。 溶解度大 (比在水中大2倍) 溶解度小 （仅为水中1%） DNP 溶解度小 溶解度大 RNP 1.0mol/LNaCl 0.14mol/LNaCl 核蛋白 此外，两种核蛋白溶解度与pH值有关 RNP：pH2.0-2.5时最低 DNP：pH4.2时溶解度最低 故调节溶液pH也可促使两者分离，将0.14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。 ⒊ 去除蛋白质 用蛋白质变性剂或水解使RNA与蛋白质分离，故加入蛋白质变性剂如氯仿、异戊醇、SDS、热酸等，使蛋白质变性沉淀，从而核酸和蛋白质分离，经离心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性蛋白质凝胶和氯仿 ⒋ 纯化RNA 核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的RNA提取液 ㈡ 实验操作 新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液，加0.14mol/LNaCl溶液制成20%匀浆 取匀浆4mL,3500rom离心15min, 沉淀 上清液,倒入另一离心管,记录体积 加入等体积氯仿-异戊醇混合液,剧烈震荡10min (用吸管反复吹打至发白为止),3500rpm,15min 上清液,倒入另一离心管中,记录体积 加2倍体积95%冰乙醇玻璃棒搅拌，3500rpm15min 沉淀(RNA),先用1mL0.1MNaOH溶解，后用蒸馏水定容至15mL 鉴定或定量测定 新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液，加0.14mol/LNaCl溶液制成20%匀浆 取匀浆4mL,3500rom离心15min, 沉淀 上清液 加入等体积氯仿-异戊醇混合液,剧烈震荡10min (用吸管反复吹打至发白为止),3500rpm,15min 上清液 加2倍体积95%冰乙醇玻璃棒搅拌，3500rpm15min 沉淀(RNA),先用1mL0.1MNaOH溶解，后用蒸馏水定容至15mL 鉴定或定量测定 二、RNA定量测定 RNA 水解 强酸 含氮碱基+戊糖+磷酸 测定三者中的任何一种成分即可计算核酸的含量，有三种方法：测糖法、测磷法、紫外吸收法 ㈠ 测糖法 核糖 浓HCl,FeCl3 △ 3H2O 糠醛+3,5-二羟甲苯→绿色化合物 （地依酚） 670nm比色 0 200 160 120 80 40 RNA含量 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 地依酚试剂 1.5 2.0 0 0.4 0.8 1.2 1.6 蒸馏水 0.5 0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 RNA标准液 5 4 3 2 1 测定管 空白管 管 准 标 各管混匀，置沸水浴25min，冷却，670nm空白管调零，测各管吸光度 ⒈ 标准曲线的绘制及样品测定 *