蔗糖酶.doc

3.1 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 自1860年Bertholet从啤酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（ivertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuraoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（exteral yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（iternal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和et，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似。 本实验未区分内酶与外酶，是直接从酵母粉中进行提取。用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 该实验共有九个分实验，几乎覆盖了酶分离纯化、鉴定及其酶学性质研究的全部内容，为学生提供了一个较全面的实践机会，学习有关酶的分离纯化及其相关研究。 1蔗糖酶的提取与部分纯化 2离子交换柱层析纯化蔗糖酶 3蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 4分离产物的SDS－PAGE电泳检测 5反应时间对产物形成的影响 6pH对酶活性的影响和最适pH的测定 7温度对酶活性的影响和最适温度的测定 8底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 9尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 3.1.1 蔗糖酶的提取与部分纯化 3.1.1.1 1）学习微生物细胞破壁方法。 了解有机溶剂沉淀蛋白质的原理。 3.1.1.2 原理 微生物细胞破壁可以在外界机械压力（如超声波等）和一些酶（如蜗牛酶）的共同作用下使得细胞壁破碎，还可以将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞破坏，使得细胞内物质释放出来。根据蔗糖酶的性质通过热处理、离心、有机溶剂沉淀等方法将目的蛋白进行初步分离纯化。 3.1.1.3 试剂1）啤酒酵母 2）二氧化硅 3）甲苯（使用前预冷到0℃以下） 4）去离子水（使用前冷至4℃左右） 5）冰块、食盐 6）1 乙酸 795%乙醇 3.1.1.4 仪器 1研钵 2离心管 3滴管 4量筒 5水浴锅 6烧杯 7广泛pH试纸 8高速冷冻离心机 3.1.1.5 操作步骤 提取 根据干粉酵母和湿酵母的差异，提供三种粗提的方法供大家选择，本实验采用的是第二种方法自溶法。 （1）研磨法 a.准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 b.称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅（二氧化硅要予先研细），放入研钵中。 c.量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 d.缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30min。以便将蔗糖酶充分转入水相。 e.将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 f.用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10 000rpm，离心10min。 g.将上清液转入量筒，量出体积，留出2ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 h.用广泛pH试纸检查清液pH，用1 mol乙酸将pH调至5.0称为粗级分I。 自溶法 a.15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30min，观察菌体自溶现象。 b.抽提补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜，8 000r 离心10min，弃沉淀及脂层，得E1（无细胞提取液）； 量体积V1。（取出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度）。 注：乙酸钠保持弱碱性条件、35℃、加入乙酸乙脂代替防腐剂。 反复冻融法 称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛