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赣南师范学院生命与环境科学学院 毕业论文实验方案 论文题目：滤纸糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究 学生姓名：刘淼 学号：100907025 指导老师：卢占军博士 起止时间：2013年3月-6月 实验原理:利用蛋白质分离纯化方法，从枯草芽孢杆菌中分离出纤维素酶，将其分别作用于羧甲基纤维素（CMC）和滤纸，其生成的还原性糖能和3.5--二硝基水杨酸（DNS）反应生成棕红色物质，利用分光光度法测出纤维素酶的活性强度。 纤维素酶 滤纸糖 纤维二糖、葡萄糖等还原性糖 +DNS 棕红色物质 药品材料：氢氧化钠、葡萄糖、3.5--二硝基水杨酸（DNS）、硝酸、冰醋酸、醋酸钠、酒石酸、滤纸、纤维素酶制剂； 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、干燥箱、分析天平； 实验设计： 实验前期准备工作: 醋酸-醋酸钠缓冲液的配制：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸溶液。 称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸钠溶液。使用时以4：6的比例混合，低温冷藏备用。 葡萄糖溶液的配制：将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。 3、3.5--二硝基水杨酸的配制：准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。 葡萄糖标准曲线的绘制：取8支洗净烘干的25mL 具塞刻度试管，编号后依次加入0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml 1.2ml1.4ml葡萄糖标准溶液,然后用蒸馏水分别定容至2.0ml。配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25mL，充分混匀。在540nm 波长下，以1 号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。 滤纸对实验的影响分析：由于滤纸中也含有一定量的还原性糖，所以试验中应该排除底物对实验的影响。称取等量碾碎的滤纸与DNS充分反应，测其OD值。 酶促反应时间的研究：酶的反应时间不同，其产物浓度也不一样。依次取反应时间为0min 2min 4min 6min 8min 10min 12min14min的反应体系，加入DNS充分显色测其OD值。 DNS试剂量的确定：DNS本身也具有一定的颜色，如果过量也会对实验结果造成影响，所以应该设计实验确定DNS的加入量。取相同酶反应体系，分别加入0.3ml 0.6ml 0.9ml 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml显色剂DNS充分显色，测其OD值。 吸收波长的确定：取450nm-590nm波长段，以每20nm一个区段，分别测其OD值，绘图分析结果。 沸水浴显色时间的确定：取相同酶反应体系，DNS沸水显色分别取1min 3min 5min 7min 9min 11min 13min 15min的OD值，分析结果。 显色后吸光度稳定性的研究：分别测量反应体系显色后15min 20min 25min 30min 35min 40min 45min 50min的吸光度，分析结果。 数据的处理，绘图以及结论分析： 论文写作： 目的要求 （1）学习并了解生物化学实验的基本过程与基本方法，培养发现问题、解决问题的能力，养成科学实验的良好习惯。 学习并了解纤维素酶的基本特性，学习酶活力测定的方法。 学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法。 学习实验方案的制定与调整、数据的处理及实验报告的撰写。 二、实验基本要求 根据相关资料，提出实验方案 实验前，根据有关资料，了解该酶的基本特性、酶活力测定的基本原则与要求，拟订初步实验方案，包括实验原理，实验的步骤及目的等。 修订实验方案 提出实验方案，经过老师修改后，确定最终的实验方案，并开始进行实验。具体任务是：制作还原糖—吸光度的标准曲线；测定样品中的纤维素酶活力。 数据处理与实验报告 根据实验测定的结果，采用计算机分析处理有关实验数据，并利用计算机绘制标准曲线，计算相关系数（r），利用回归方程计算获得