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《微生物学与免疫学实验》
本学期的免疫学实验内容
? 八个实验，四周完成：
1. 抗血清的制备与分离（1）
2. 巨噬细胞的分离与形态观察(1)
3. 抗体的纯化——硫酸铵沉淀（2）
4. 双向琼脂扩散——检测特异性抗体（2）
5. 酶标抗体制备及其提纯（3）
6. 单向琼脂扩散——测抗体效价（3）
7. 酶联免疫吸附试验——ELISA（4）
8. 凝集试验——快速检测（4）
今天的实验内容与要求
? 实验7. 酶联免疫吸附试验（ELISA）
? 实验8. 间接凝集试验法检测血清类风湿因子（凝集试验）
要求：
? 掌握ELISA的技术原理与操作方法
? 了解检测血清类风湿因子的免疫学快速检测方法——
凝集试验
今天的上课流程：
①进行实验7. ELISA 的“封闭”步骤的操作，等待30min
②讲解约30min
③进行实验7. ELISA的一抗加样，孵育等待30min
④进行实验8. 凝集试验的操作
⑤进行实验7. ELISA的二抗加样，孵育等待30min
⑥进行实验7. ELISA的显色步骤，孵育15min，观察结果
实验7. 双抗体夹心ELISA法检测人血清中
的抗体含量
1. 抗体包被：将羊抗人IgG抗体预先包被于96孔酶标板上，包
被量是100 μl/孔，4℃包被过夜（已完成）；
2. 封闭：每小组领取1个板框，内含1条12孔的板条，在水槽中
甩净孔中液体，加入约400μl PBST洗涤液，注意别溢出，静
置30秒，甩净，扣干。然后，用记号笔标记小组号和孔编号，
每孔加入200 μl的2%小牛血清，放入37 ℃温育30 min；
1 2 3 4 5 8 9 10 11 12
A同学 B同学
酶联免疫吸附实验
(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)
1. 将抗原或抗体吸附于固相载体表面，并保持其免疫
学活性；
2. 将抗原或抗体进行酶标记，并使酶标产物保持其免
疫学的特异结合活性和酶学的信号放大活性；
3. 利用抗原抗体的特异性免疫反应以及酶的催化活性
进行抗原抗体的定性或定量分析。
ELISA的一般实验步骤
间接ELISA为例
包被
1. 反应产物
↓
2. 封闭 （6）
↓ 加入底物
3. 加样（抗原抗体反应） （5）
↓ （4）
4. 加酶（酶标抗体结合） 酶标抗体
抗原抗体结合 结合
↓ （3）
5. 显色（加底物） 包被 封闭
↓ （1） （2）
6. 读值（测定显色反应）
包被（Coating）：
以物理吸附的方式使抗原或抗体与固相载体相结合
? 包被吸附作用力：疏水相互作用
? 包被的固相载体：聚苯乙烯塑料（96孔微孔板或小试管等）。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其
上仍可保留原来的免疫学活性
? 包被缓冲液：pH 9.6碳酸盐
或 pH 7.4磷酸盐
? 包被温度：4℃冰箱放置过夜
或37℃保温2小时
? 包被浓度：ng/well
封闭
? 抗原或抗体包被时所用的浓 反应产物
度较低，吸附后固相载体表
面尚有未被占据的空隙。封 加入底物
闭可以充填空隙，阻止后续
加入的酶标物质的再吸附， 酶标抗体
结合
从而消除非特异性反应 抗原抗体结合
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