核酸分子杂交技术与应用.ppt

第九章 核酸分子杂交技术与应用; 第一节 杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。;（2）.引起核酸变性的因素;（3）、变性核酸的特点： 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加 ;2、融解温度：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最  大值一半时的温度。 ;;影响Tm的因素： （1） DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低;（2）溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高;3、复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度;;4、杂交 ; ; ;二、核酸探针（一）探针的概念 探针（probe） 指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。;（二）探针种类和选择1.探针种类（1）基因组DNA探针  为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。（2）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 （3）RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。（4）寡核苷酸探针;2.探针的选择 高度特异性，一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。 ?;三、探针标记原理与方法 理想的探针标记物应具备①高度的敏感性 ②标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基  配对及探针分子的主要理化性质；③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳 性绿低外，尚需考虑环境污染少，价格低；④若用酶促方法标记，应对酶的Km值影响不 大，以保证标记反应的效率和标记产物的 比活性。;（一）、标记物  放射性同位素标记物  非放射同位素标记物; 1.放射性同位特点： ●放射自显影技术检测，信号的强弱通过 计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用 ;2. 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备  不存在放射性污染;（二）放射性同位素标记法探针标记法 酶反应法 化学反应法常用标记探针的同位素 32P 3H 35S 131I 125I 14C; 全程标记1、随机引物法（random priming） 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新DNA链。;; 2、切口平移法◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，  切口处形成3’-OH末端。◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用，  以另一条DNA链为模板。◆4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口 水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷  酸同时进行，切口平行推移。 生成的两条链都被同位素均匀标记。;大肠杆菌DNA聚合酶I（1）5’ 3’聚合酶活性;（2）3’ 5’外切酶活性;（3）5’ 3’外切酶活性;;3、全程RNA探针标记4、化学法全程标记; 末端标记法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。? 5’端标记法  3’端标记法;（1）5’端标记法