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细菌营养缺陷型菌株的诱变及筛选 摘要 营养缺陷型菌株在杂交育种、研究微生物代谢途径、遗传分析等方面具有重要应用意义。针对微生物诱变要得到的特定表型效应，具有不同的筛选方法。本次实验以紫外线作为诱变剂，诱发大肠杆菌的营养缺陷型突变，过程中用青霉素法浓缩缺陷型，基本培养基与完全培养基比对筛选，最后经生长谱法鉴定得到了一株亮氨酸缺陷性大肠杆菌菌株。 关键字 大肠杆菌，营养缺陷型，紫外诱变，筛选，生长谱鉴定 用某些物理因素或化学因素处理细胞，使其基因突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。在营养上表现某种缺陷的菌株，必须在培养基中加入某种有机营养成分后才能够正常生长。突变前的菌株称为野生型菌株，或称为原养型菌株。能够满足野生型生长的最低营养成分的合成培???基，叫做基本培养基。能够满足营养缺陷型菌株生长的培养基，叫做完全培养基。不同的微生物有不同的营养要求，因此基本培养基也各不相同。 营养缺陷型菌株，在生产实践中可作为杂交育种和发酵核苷酸、氨基酸等中间代谢产物的出发菌株或生产菌株，在遗传分析中也作为遗传分析的菌株。同时，也是研究微生物代谢途径的重要材料。 营养缺陷型的筛选一般具有以下几个环节：诱变处理，营养缺陷型的检出，划线复证，生长谱鉴定，缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离得到突变型。 本次实验用紫外线来诱发大肠杆菌基因突变，并用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型，掌握细菌营养缺陷型诱变及选育方法。 1. 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1实验器材 1ml、200μl枪尖各一盒、牙签一瓶、500ml锥形瓶、100ml锥形瓶、试管、7cm培养皿、9cm培养皿、量筒、移液枪、玻璃棒、紫外灯、黑布、恒温培养箱、离心机、涂布棒、电子天平、酒精灯、接种环等。 1.1.2实验材料 1.1.2.1 菌株 大肠杆菌E.coli K12。 1.1.2.2培养基 LB液体培养基： 酵母膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水，100ml，pH7.2 。 2×LB液体培养基： 酵母膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水50ml，pH7.2。 基本培养基： Vogel 50×(即浓缩50倍)：MgSO4·7H2O 10 g，柠檬酸100 g，NaNH4HPO4·4H2O 175g, K2HPO4·2H2O 599.88 g (K2HPO4·3H2O 656.319 g),水600ml。 使药品溶解后再定容至1000ml。（配好后，放入冰箱保存备用）。 基本固体培养基：50× 2ml，葡萄糖2g，蒸馏水98ml，琼脂2g，PH7.0，110℃灭菌20min 无N基本液体培养基： K2HPO4 0.7g；KH2PO4 0.3g; 柠檬酸钠· 3H2O 0.5g；MgSO4 ·7H2O 0.01g; 葡萄糖2g,蒸馏水100ml，pH7.0，110℃灭菌20min 2N基本培养基： K2HPO4 0.7g；KH2PO4 0.3g; 柠檬酸钠·3H2O 0.5g；MgSO4·7H2O 0.01g; (NH4)2SO4 0.2g;葡萄糖2g；蒸馏水100ml，pH7.0，110℃灭菌20min 完全培养基： 同LB培养基，固体培养基加 2%琼脂。 混合氨基酸和混合维生素 实验方法 1.2.1诱变处理 第一天，接种：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜。 第二天，诱变：早上添加5mlLB液，继续培养4-6小时；取5ml菌液于离心管中，7000rpm离心3-4分钟，弃上清，加生理盐水5ml，洗涤一次，再加入生理盐水5ml打匀沉淀；吸取菌液3ml于小培养皿（7cm）内，将培养皿置于15W紫外灯下30cm处（处理前紫外灯预热30min），将培养皿连同盖一起置于15W紫外灯下灭菌1min，然后打开皿盖照射2min，照射后先盖上皿盖再关灯；吸3ml 2倍LB液加入处理过的菌液平皿内，混匀，用黑布（纸）包好，置37℃避光培养12h以上。 1.2.2营养缺陷型浓缩 第三天，延迟处理：吸菌液3ml于离心管中，7000rpm离心3-4min，弃上清。离心洗涤两次（加4ml生理盐水，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成3ml菌悬液。取0.2ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。（消耗体内的N素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死） 第四天，初筛：按1:1比例加入2N基本培养液5ml，加入10μg/ml氨苄青霉素溶液20ul，使氨苄青霉素在溶液中的最终浓度约为20μg /ml，再放入37℃培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死亡。缺