人外周血白细胞分离液使用说明.pdf

人外周血白细胞分离液使用说明 货号: P8670 规格：200ml/kit 保存：1 8℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。 一、 分离方法说明及图例 A．取1ml新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液1:1混匀后小心加于1份本分离液之液面上； B. 以500g（约1800转/分）离心25分钟(半径15cm水平转子)。此时离心管中由上至下细胞分 四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色的白细胞层。第三层；为略带混浊的分离 液层（富集一定量的白细胞）。第四层；为红细胞层。弃去第一层血浆层，收集第二层细胞、 第三层分离液层和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，以500g 约（1800转/分）离心30分钟。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤 去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需白细胞。 注： 提取率约为80%。 二、红细胞裂解液使用说明 红细胞裂解液用于从血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。不适用于禽 类等有细胞核红细胞的裂解。本裂解液经过无菌处理，分离的细胞可以用于后续的原代培养、 细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。 使用说明： A. 对于组织细胞样品： a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 b. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。如细胞沉淀的体积 为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。 c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不 会影响后续的一些检测。 e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心 2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀???积 的5倍。4℃离心效果更佳。 f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也 更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同 时需要大体积的离心管。 B. 对于血液样品： a. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。 b. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体 积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血 液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中 宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。 c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不 会影响后续的一些检测。 e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心 2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积 的5倍。4℃离心效果更佳。 f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：对于微量或少量的血液样品，可以在第一步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步 中加入10倍血液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5 分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且 裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。 三、 注意事项 A． 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在18℃-25℃避光保存，启封后置4℃保存 避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶，影响