第九章-载体.ppt(1.4MB).ppt

第九章;作为一个理想的载体，应具备以下条件： ;载体的种类：;第一节;一、质粒的一般特性;(二)质粒DNA的构型;单链切割;(三)质粒DNA的理化性质;(四)质粒DNA的生物学特性;(四)质粒DNA的生物学特性;(五)质粒的命名原则;二、组建理想质粒载体必须具备的条件;根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：;(二)分子量较小;(三)带有可供选择的标记;β-半乳糖苷酶筛选系统：;lacZ;a-互补显色反应（蓝白斑筛选）;互补显色反应 ;(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点;(五)具有复制起始点(origin, ori);三、常用的质粒载体;质粒;;pUC质粒载体;质粒;pUC18质粒载体;(2)便于重组子的检测:;lacZ’;重要的大肠杆菌质粒载体;(3)具有多克隆位点(MCS)区段;pGEM系列;pGEM系列与pUC系列之间的主要差别;pGEM-3Z：;(二)表达载体;pKK表达质粒载体 ;;融合表达载体系统 ;该载体具有以下优点：;该载体具有以下优点：;QIAexpress 6×His表达系统;第二节;一、λ噬菌体;;GGGCGGCGACCT;;图3-1 λ噬菌体基因组结构（可转化为黑白图） ;;基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：;（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。;（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。;调节元件或调节基因;cⅢ;;噬菌体的两条复制途径：;（二）溶源性生长：;λ噬菌体的缺陷与改造 ;二、λ噬菌体载体;λ噬菌体载体的类型;①置换型载体;这一特殊性质作为选择标记：;Xgal蓝色噬菌斑试验;加装选择标记 lacZ;凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。 Charon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。 Charon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。;②插入型载体：;插入型载体--λgt系列;插入型载体--λgt系列--λgtll;注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 ;三、柯斯质粒;粘粒的组成及性质：;pHC79;柯斯质粒pHC79系;柯斯质粒有以下优越性：;常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。 ;采用柯斯质粒作载体的困难; ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； ; ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。;;四、M13 噬菌体载体;M13噬菌体的组成和结构;M13噬菌体的外型呈丝状;单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。;M13噬菌体的基因组;4.3 M13噬菌体载体的构建;M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：;mp系列载体;mp系列载体;大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA;III VI I IV II X V VII IX VIII;;使用M13噬菌体作为载体的优点;M13mp18 和 M13mp19;M13mp18 和 M13mp19;M13噬菌体产生单双链DNA的机制：;+;M13噬菌体的生物学特性： 感染周期