32株银杏内生真菌清除DPPH自由基活性的比较研究.pdfVIP

第 28卷第 1期 2013年 3月 安 徽 工 程 大 学 学 报 Journal of Anhui Polytechnic University Vol_28．N0．1 Mar．，2013 文章编号：1672—2477(2013)01—0001—04 3 2株银杏内生真菌清除 DPP H 自由基活性的比较研究 高樱萍 ，葛飞 ，张慧敏 ，桂 琳 (1．安徽工程大学 微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽 芜湖 241000； 2．皖南医学 院 微生 物与免疫学教研室 ，安徽 芜湖 241000) 摘要 ：采用液体摇瓶培养的方法 ，以DPPH 自由基清除率为指标 ，对 32株银杏内生真菌发酵液的甲醇提取物 抗氧化活性进行初筛，不同菌株清除 DPPH 自由基活性差异较大，其中 4株菌株 DPPH 自由基清除率显著高 于其他菌株，分别为 96．68 、96．O9 、85．32％和 84．48 ．在此基础上 ，对 8株 DPPH 自由基清除率较高菌 株菌丝体的甲醇、乙酸乙酯、异丙醇、水 4种溶剂提取物的 DPPH 自由基清除率进行 比较，结果表明，甲醇和 水提取效果较好，优于乙酸乙酯和异丙醇，其中 GCZX015菌株菌丝体 甲醇提取物 DPPH 自由基清除活性最 强为 93．97 ，GCZX018菌株菌丝体异丙醇提取物 DPPH 自由基清除活性最低 ，仅为 0．11 ． 关 键 词 ：银杏 ；内生真菌 ；提取物 ；DPPH 自由基 清活性 中图分类号：Q936 文献标识码：A 自由基可引起对维持生命活动具有重要作用的蛋白质和 DNA的损伤从而加速机体衰老进程并诱发 各种疾病u]．衰老的 自由基理论最早是 由 Harma[2]提 出的．Culter在此基础上提出抗氧化剂是寿命 的决 定因子．由于人工合成的抗氧化剂存在毒性的问题如 BHA和 BHT等，因此天然抗氧化剂越来越受到人 们的关注 ． 植物内生真菌是存在于健康植物组织中，形成不明显侵染的一类真菌[4]．自20世纪 80年代以来，很 多研究者致力于有关内生真菌产生物活性物质的研究[5]．如内生真菌的抗肿瘤活性，抗菌活性，抗病原虫 活性，抗氧化活性等．其中大部分研究都集中在抗肿瘤和抗菌作用的研究，抗氧化活性的研究相对较少[6]． 银杏是现存的种子植物中最古老的孓遗植物，银杏叶提取物 EGb761有很好的抗衰老作用[7 ]，其抗衰老 作用是因为叶片中含有的黄酮类物质．黄酮类物质可以清除 o ·、·oH、ROO·等，防止脂质过氧化．因 此，从银杏组织中筛选具有抗氧化活性的内生真菌具有实际应用意义． 刘小莉等[9 对一株银杏内生炭角菌进行了抗氧化活性的研究，并对抗氧化活性物质进行了分析，鉴定 出了多种酯类、羧酸、醇类、酮类及酚类物质．本文对从银杏健康组织中分离出来的内生真菌采用 DPPH 筛选模型测定其抗氧化活性．从筛选得到的32株菌株中，选择 8株菌株进行复筛，并对其抗氧化活性进行 了比较研究．最终获得一株生长特性稳定，自由基清除率较高的菌株，可作为天然抗氧化活性物质的生物 源对其进行进一步研究． 1 实验材料与方法 1．1 实验材料 (1)样品．2010年 7月分别在安徽工程大学校园、芜湖市赭山公园采集银杏植株健康的枝、叶以及果 实．银杏内生真菌用组织分离法从银杏枝 、叶和果实中 自行分离、纯化获得． (2)试剂．葡萄糖(分析纯)、甲醇(分析纯)、乙醇 (分析纯)、1，1-diphenyl-2一picryhydrazyl(DPPH)、硫 酸链霉素、青霉素、次氯酸钠(活性氯含量 5．2 )． (3)培养基．分离培养基 ：PDA培养基．液体摇瓶培养基 ：PDB培养基． 收稿 日期 ：2012—08-10 基金项目：安徽高等学校省级优秀青年人才基金项 目(2011SQRL079) 作者简介：高樱萍(1985一)，女，山东莱阳人，硕士研究生． 通讯作者：葛 飞(1978一)，男，安徽马鞍山人，副教授，硕导． · 2· 安 徽 工 程 大 学 学 报 第 28卷 (4)主要仪器．无菌操作台(江苏苏净集团有限公司)，恒温振荡培养箱(江苏太仓市华美生化仪器厂， QHZ-123B型)，高压蒸汽灭菌锅(上海 申安医疗器械厂 ，LDZX一50KBS)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器 厂，RE一25系列)，酶标仪(Tecan SUNRIsE)，高速离心机(GL一20C)、冷冻干燥机(美国 sIM，FD-83)，超声 波清洗器 (合肥金尼克机械制造有限公司，JK-300CDE型)． 1．2 实验方法 (1)银杏内生真菌的分离．将采集到的新鲜、健康的银杏枝、叶以及果实的表面清洗干净．按以下方法 进行表面消毒：在无菌操作台中用 95 乙醇漂洗 2 min，然后用无菌水冲洗，再用 5．2 次氯酸