第三章生物制品的制备选编.ppt

第三章 生物制品的制备P62NP80;一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （1）原料选择 原料的选择原则： ①有效成分含量高，新鲜； ②原料来源丰富，产地较近； ③原料中杂质含量少； ④原料成本低等。; ①植物原料生长的季节性； ②微生物原料的对数期； ③动物原料的年龄与性别。; ①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。 ②植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理； ③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。 ; ①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。 ②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。 ③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。 ;生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。 ;细胞破碎;动物细胞: 多分泌到细胞外培养液 植物细胞: 多为胞内产物 微生物（细菌/真菌）: 胞内、胞外 对于胞内产物需要进行细胞破碎。　;胞外：大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 胞内：有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。;细胞破碎方法;一、机械破碎方法;二、物理破碎方法;物理破碎法的分类;三、化学破碎方法;四、酶学破碎方法;自溶作用 ;（2）提取（extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质， ①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。 ②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。 ③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。 ; 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： 1.沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原???是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等。 2. 超滤法和透析法、凝胶层析法、超速离心法等：按分子大小分离的方法。;3.离子交换层析、电泳法、等电点聚焦法等 是按分子所带电荷进行分离的方法，氨基酸、多肽、蛋白质、酶均具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。 4. 亲和层析法 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。 亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。 ;;基因工程产物的特点： 产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎 产物浓度较低，杂质多，提纯困难 产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活;1. 含目的产物的起始物料的特点 ①菌种类型及其代谢特性。 ②原材料和培养基的来源及其质量； ③生产工艺和条件。 ④初始物料的物理、化学和生物学特性。 目的产物的表达特性。 目的产物本身的分子特性。 目的产物的用途和需求量。;分离纯化的基本过程 分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高； 另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。;分离纯化一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎 、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。;;1、根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物：发酵液的体积很大、但目标产物浓度较低，必须在纯化前进行浓缩，可用沉淀和超滤的方法浓缩。 产物在周质表达： 为了获得周质蛋白，E.coli经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透压裂解的方法来获得，能够回收到高质量的产物。 可溶性表达产物：破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。 ; 应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。;分离单元之间的链接：Ｐ80，ＮＰ100 ①先选用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）； ②随后采用高分辨率的操作单元（如