大肠杆菌O157∶H7微滴数字PCR定量方法的建立.pdfVIP

第43卷 2015年 3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Joumal of Analytical Chemistry 第 3期 319～324 DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．140569 大肠杆菌 O157：117微滴数字 PCR定量方法的建立 董莲华 张 玲 姜 君 王江南。 王 晶 陈唯军 (中国计量科学研究院，北京 100029) (中国科学院北京基因组研究所基因组科学与信息重点实验室，北京 100029) (北京市计量检测科学研究院 北京 100029) 摘 要 以大肠杆菌0157：H7(E．coli O157：H7)rfbE基因为靶基因，建立了可对其准确定量的微滴数字 PCR(ddPCR)方法。对 ddPCR反应中的探针浓度进行了优化，考察了方法的线性范围、精密度 、定量限和检出 限。最终确定 ddPCR反应 中的最佳探针浓度为 300 nmol／L。E．coli 0157：H7基 因组 DNA浓度范 围为 4～1．25×10 拷贝／20 L ddPCR反应液时，ddPCR方法线性相关系数(R )为 0．999。当 DNA浓度为 760～ 88400拷 贝／20 IxL时，方法 的精 密度最好 (RSD5％)。本方 法的定 量限为 4拷 贝／20 IxL，检 出限为 3拷贝／20 LL。特异性验证结果表明，建立的 ddPCR方法特异性 良好，对 13份猪肉、牛肉和鸡肉样品的检测 结果与定量 PCR方法检出结果一致。 关键词 微滴数字聚合酶链式反应 ：大肠杆菌 0157：H7：拷贝数 1 引 言 大肠杆菌 0157：H7(E．coli O157：H7)是肠出血性大肠杆菌常见的血清型，是以食物为主要的传播 途径的致病菌，牛、羊、猪和鸡等家畜家禽是其主要宿主 1̈-2]。可引起严重并发症，甚至导致死亡，死亡 率可达5％ 10％。近年，肠出血性大肠杆菌 O157：H7感染在世界各地都有不同规模的爆发和流行，在 世界范围内都受到普遍关注。此外，E．coli O157：H7的感染剂量极低 ，在食入不足 10个细菌就可能引 起疾病Ⅲ2， 目前还没有一种特效药或有效的治疗手段，因此建立快速、有效的检测方法对 E．coli O157：H7的预防工作显得尤为重要。 目前，检测肠出血性 E．coli O157：H7的方法可分为传统方法、免疫方法和分子检测方法。传统的 分离培养法和生化鉴定时间长，灵敏度低；免疫学方法虽然检测时间相对较短_4]，但是容易发生于大肠 杆菌的多种血清型的交叉反应。刘霞等 采用纳米金标记抗体增强表面等离子体共振(SPR)传感器对 E．coli O157：H7进行检测。随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应 (PCR)方法被广泛用于 E．coli 0157：H7疾病的快速诊断中。实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR。qPCR) ]技术以 其特异性强、灵敏度高、速度快等优点在基因表达、病原体基因检测等方面得到广泛应用，已经成为当前 细菌快速检测的重要方法，并 已成功用于不同来源的 E．coli O157：H7的检测中I8 。如 Fratamico 等_】。。建立了不同食品中针对 stxl、stx2、wzyO157、eae和 fliC目标基因检测 E．coli O157：H7的多重定量 PCR方法。Boneta等_】 ]建立了一步富集法结合 PCR方法检测地表水中的E．coli 0157：H7，解决了由 于方法灵敏度的限制而难以检测地表水中的E．coli O157：H7，检测限低至3 CFU／L。 微滴数字 PCR方法(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的快速、准确、可实现 DNA绝 对定量的 PCR方法。其原理是通过把稀释到一定浓度的 DNA分子分布在一定数 目的微滴中，使大部 分微滴中的DNA分子数目为 l或0，然后通过 PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目．再根据 泊松分布计算出样本中的DNA分子数ll ]。本方法无需依赖外部核酸标准，可实现核酸绝对定量分 析。ddPCR与 qPCR方法相比，本方法无需核酸标准品，又兼具 qPCR方法的优点，用于环境微生物l】6] 和病原体基因的检测具有更广阔的应用前景。因此，研究和建立 E．coli O157：H7的 ddPCR方法。对 2014-07-03收稿；2014—12-01接受 本文系中国计量科学研究院基本科研业务费资助项 目(Nos．AKY1323—14，AKY1408．14) E-mail：donglh@ nim．ae．cn 320 分 析 化 学 第 43卷 E．coli 0157：H7的快