第四章沉淀法选编.ppt

第四章 沉 淀 法 (precipitation);生物分离过程的一般流程;沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。;;沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：;沉淀法操作步骤： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。;沉淀生成动力学;为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀 ;沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 ;沉淀法的分类; 蛋白质的溶解特性;蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域;蛋白质的溶解特性;防止蛋白质凝聚沉淀的屏障;;盐析;盐析法机理;;盐析过程;;盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济;盐析用盐的选择;;盐析操作(加盐方式）;;㏒S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率;β和Ks的物理意义 β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关??? Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率； 从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。;用盐析法分离蛋白质的二种方法;盐析用盐量的确定-饱和度：;原蛋白溶液体积为V，欲使其硫铵饱和度达到S，需加入饱和硫酸铵溶液的体积数？;原来蛋白溶液的饱和度为S1，现希望其饱和度增加为S2，需加入多少体积的饱和硫酸铵溶液?;加固体硫铵的方法;在20 ℃时使1L M1摩尔浓度时（NH4）2SO4溶液增至M2摩尔浓度，所需加入（NH4）2SO4的克数C：;在20 ℃时使1升S1饱和度时（NH4）2SO4溶液增至S2饱和度，所需加入（NH4）2SO4的克数：;以上数据都可在有关书上查到 ;20;盐析的影响因素：3）pH值;;盐析影响因素：4）温度的影响;盐析的影响因素：5）蛋白质浓度;对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。;盐析注意事项;盐析注意事项;盐析法特点：;;等电点沉淀法;蛋白质的离子化情况既与蛋白质的详细结构有关，也与溶液的pH值有关。一般来说，溶液的pH值高，蛋白质带负电；pH值低，蛋白质带正电。当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，或者说它带相等的正电荷和负电荷，这时的pH值称为等电点，常用pI表示。 两性电解质在溶液中pH处于等电点pI时，分子表面静电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低并沉淀析出。 ;等电点沉淀法;①等电点沉淀法操作十分简便，试剂消耗少，给体系引入的外来物(杂质)也少。是一种常用的分离纯化方法， ②收率低：但两性溶质（蛋白质）在等电点附近（处）仍有一定的溶解度，(有时甚至比较大)，所以等电点沉淀往往不完全。即等电点沉淀法往往不能获得高的回收率。;; 等电点沉淀注意事项 (1) 生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化。 由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低。即：若蛋白质分子结合多量阳离子如：如Zn2+、Ca2+ 、Mg2+等，会造成等电点升高；若蛋白质分子结合多量阴离子如：如Cl-、SO42-、HPO42-等，则等电点降低。 自然界中许多蛋白质较易结合阴离子，使等电点向酸侧移动。;;;概念：在含有