β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析的论文.docVIP

　　β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析的论文 作者：李黄金,陈伟,赵林,黄志健 【摘要】 目的 构建含εnh2标记位点的克隆酶供体免疫分析(cedia)系统供体片段。方法 从大肠杆菌基因组克隆β半乳糖苷酶(βgal)的α片段基因，通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变，与硫氧环蛋白(trx)融合表达后与δα片段进行酶学互补活性分析。结果 克隆的α片段为βgal n端1-56多肽片段，定点突变得r14k、r53k和r14k/r53k等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上，且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性，其中r53k突变体的活性远高于r14k和r14k/r53k的，且与野生型α片段的基本一致。结论 α片段r53k突变体具有作为cedia系统含内部标记位点供体的潜力。 【关键词】 β半乳糖苷酶;供体;标记位点;互补 　　(school of life sciences and biopharmaceutics,guangdong pharmaceutical college,guangzhou,guangdong 510006,china)abstract:objective to introduce an internal εnh2 for conjugated analyte into donor of cloned enzyme donor immunoassay ( cedia ).methods α gene of βgalactosidase escherichia coli,and introduced lysine code by sitespecific mutagenesis. α genes oter t7 in e. coli origami (de3),then screened by plementation assay ent after purification.results an αgene coding 156 aa utants r14k、r53k and r14k/r53k utants,r53k shoent’s and far higher than other mutants’.conclusion mutant r53k could be potentially used as a donor containing internal εnh2 for cedia. 　　key entation 　　克隆酶供体免疫分析(cloned enzyme donor immunoassay,cedia)技术是一种基于β半乳糖苷酶(βgal)α互补的均相酶免疫分析技术[1]，由于特异性强、灵敏度高、且操作简单而快速，目前已广泛应用于临床检验、药物滥用筛查、食品有害残留检测与环境污染监控等方面[2，6]。.cedia系统由βgal酶供体(α片段)、受体(δα片段)、标记抗原(待测物)和抗体组成，抗体与标记抗原的结合可导致βgal互补活性的下降，而当样品中含有待测抗原时，待测抗原与标记抗原竞争结合抗体，并最终表现为样品中的抗原浓度与酶活性呈正相关。由于对受体片段的任何化学修饰均会导致其互补活性的丧失[7]，所以抗原只能标记于较小的供体片段。εnh2是最具标记活性的基团之一[8]，但天然供体片段中缺乏含εnh2的赖氨酸。本文报道了一种含εnh2基的、具有作为cedia供体片段潜力的βgal α片段突变体。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌dh5α和bl21(de3)由本室保存，大肠杆菌origami(de3)和表达载体pet32a 为novagen公司产品;taq酶、限制性内切酶、t4 dna连接酶、dna lader和蛋白质marker等均为大连宝生物工程有限公司产品;pcr产物回收试剂盒和dna凝胶回收试剂盒购自百泰克生物技术有限公司;histrap ff柱(1 ml)为ge公司产品;bca试剂盒为广州美津生物技术有限公司产品;咪唑(分析纯)为广州化学试剂厂产品;tanon4100全自动数码凝胶图像分析系统为上海天能科技有限公司产品。 　　1.2 引物设计与合成 　　α片段克隆与突变用上游引物分别为αf和αfm，αf的序列为5′tagccatgggttcactgg ccgtcgttttac3′，αfm的序列为5′tag ccatgggttcactggccgtcgttttacaaaagcgtg actgggaaaac3′， 其中下划线处为ncoⅰ位点;α片段克隆与突变用下游引物分别为αr和αrm，αr的序列为5′ta