人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备的论文.docVIP

　　人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备的论文 【摘要】 目的 克隆表达重组人生存素，制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法 用rtpcr方法从培养的人白血病细胞株hl60中克隆人生存素 cdna，克隆到原核表达载体pet32a（+），重组质粒转化大肠杆菌bl21（de3）进行表达，目的蛋白经ninta 树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清，elisa检测抗血清的效价，t easy购于promeg公司；hl60细胞、胃癌细胞株sgc7901和胰腺癌细胞株panc1由本室保存，总rna提取试剂盒与ninta 树脂购于德国qiagen公司；限制性内切酶bamh ⅰ、hind ⅲ、rtpcr反应体系、cdna合成试剂盒均购于立陶宛mbi公司；胶回收试剂盒hb101购于美国q.biogene公司；质粒抽提试剂盒购于上海华舜生物有限公司；测序由上海基康生物有限公司完成；dna marker(λ/ecot14、dl2000)、蛋白质marker购于大连宝生物有限公司；hrp标记的羊抗鼠抗体购于santa cruz公司。 1.2 方法 1.2.1 人生存素基因的克隆及测序 以rpmi1640复合培养液培养hl60细胞至2×107，以100u/ml的rhil3刺激24h后，收集细胞并以pbs缓冲液洗涤3次，用总rna提取试剂盒提取总rna，电泳检测rna的量与纯度；按r