DsDNA使用TBK1-IRF3信号通路.docVIP

DsDNA使用TBK1-IRF3信号通路 在我们对DNA免疫刺激效应理解上的下一步飞跃始于意识到当被直接导入细胞质时非病原菌来源的DNA也是有免疫刺激性的。在我们实验室的调查中揭示dsDNA，当用胞质转染法转染时是一个IFN-Ⅰ和趋化因子基因如Cxd10,Cd5和Cd2潜在的诱导物在小鼠和人的树突细胞以及间质细胞。关于免疫原性的条件在添加的CpGDNA和转染的dsDNA之间是不同的。如果不考虑这些序列，胞质dsDNA仍然是有刺激性的并且可以诱导IFN-Ⅰ即使当它是甲基化的。这不只限于病原来源的DNA，因为当转染时那些缺乏CpG岛的小牛胸腺和人造DNA和E.coli以及HSV-1有相同的刺激性。此外，之前被证明由于缺乏TLR9表达而对CpG无反应的小鼠胚胎成纤维细胞当用DNA转染时表现出IFN-Ⅰ的诱导效应。这种dsDNA的IFN-Ⅰ刺激效应依赖于它的长度。长的dsDNA诱导更强的IFN-Ⅰ反应。只有dsDNA是有刺激性的；ssDNA如互补DNA(cDNA)被发现是免疫惰性的。这种刺激效应也只限于B型（B-DNA）的dsDNA而非Z型(Z-DNA)构象。B-DNA是一种dsDNA结构普遍出现的低能状态采用右手螺旋构象。相反，Z-DNA采用高能的左手螺旋结构在生理状态下出现较少。人造由AT重复聚（dA–dT）.聚（dT–dA）(聚（dA.dT）将来)dsDNA倾向于采用B型构象并且当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时可以诱导潜在的IFN-Ⅰ反应。另一方面，由GC重复组成的人造dsDNA，聚（dG-dC）聚（dC-dG）聚（dG-dC）将来），采用Z型构象，当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时没有刺激性。这些DNA的第二结构仍然是完整的即使和基于脂质体的转染试剂混合时。 我们也通过研究在那时已知的其他的核酸感受器和信号分子是否参与B-DNA诱导IFN-Ⅰ的反应来探究机制。在胞质内感受dsRNA的TLR通路和RIG-Ⅰ通路没有参与，基于在缺乏MyD88/TRIF和RIG-Ⅰ的小鼠胚胎成纤维细胞上的试验研究。尽管胞浆DNA诱导IFN-Ⅰ反应不依赖于RIG-Ⅰ信号，我们表明在HEK293细胞中IPS-1对产生IFNβ的最优反应是必需的。这些数据在出版那时是令人不解的，但是现在我们知道RNA酶Ⅲ可以从poly(dA:dT)到刺激RIG-Ⅰ充当RNA中介。这个通路存在于人的细胞中，但在小鼠的细胞中是多余的（在之后的章节中讨论）。随后，我们把我们的注意力转向TBK1，之前发现对于在感染期间通过病毒的dsRNA诱导IFN-Ⅰ是必需的。TBK1是非经典的IκB激酶和IKKα以及IKKβ相关，是NF-κB活化的调节者。它在NF-κB活动和IFN-Ⅰ反应中起中介作用由TLR依赖和非依赖途径触发。TBK1也已证明对于当用CpGDNA刺激时类胞浆树突状细胞产生IFN-α是非必需的。和那个观察形成对比，我们表明IFNβ和其他的由B-DNA转染诱导的趋化因子反应在TBK1-/- 小鼠胚胎成纤维细胞是完全没有的。TBK1对于IRF3的二聚化是必须的，由B-DNA所诱导，但B-DNA诱导NF-κB激活是多余的。因此TBK1-IRF3信号轴对于由胞浆B-DNA刺激诱导IFN-Ⅰ是至关重要的。 B-DNA的刺激效应也被发现是功能性的通过执行基因系列WT,TBK1-/-,IKKi-/-和TBK1-/-IKKi-/-基因双敲除小鼠胚胎成纤维细胞，由聚（dA:dT）所刺激。结果表明大多数的上调基因是干扰素诱导基因也是抗病毒相关基因如MX1和QASL2。因为这个原因，当用dsDNA预培养时，WT MEFs,而非TBK1-/- MEFs，能更好地免受水疱口炎病毒的威胁。除了越来越多的抗病毒反应外，TBK1依赖的通过DNA诱导IFN-Ⅰ的反应也被发现对DNA疫苗的功效至关重要。缺乏TBK1的小鼠不能诱导抗原特异性的CD4和CD8T细胞以及产生IFNγ脾细胞的增加频率，当用流行性感冒病毒DNA免疫时。 和我们的研究相似，Stetson et al.表明非微生物来源的dsDNA如果转入胞浆可以有刺激效应且由胞浆dsDNA引起的免疫激活特点不同于CpGDNA。作者们始于通过证明直接转入单核细胞增多性李斯特氏菌，嗜肺军团菌以及凋亡的哺乳动物细胞的DNA到巨噬细胞的胞液可以诱导潜在的IFNβ以及IL-6反应。这个反应不依赖于MyD88,TRIF和RIP2，因此不涉及TLR以及NOD1/2信号。通过进一步研究这个新的感受DNA的信号途径，他们合成了一个没有CpG岛的45bp的寡核苷酸并把它命名为干扰素刺激DNA（ISD）。ISD在细胞中不能诱导任何细胞因子激活当被转染入免疫和非免疫细胞系。不同于CpG对浆细胞样树突状细胞的严格刺激，ISD能诱导所有细胞类型包括浆细胞样树突状细胞，常规树突状细胞，巨噬细胞和小