应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶.PDFVIP

第 31 卷 第 6 期 华 侨 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) Vo l. 31 No . 6 2010 年 11 月 Jo urnal of H uaqiao U niversity ( Natural Science) N ov. 2010 文章编号: 10005013( 2010) 06066106 应用易错 PCR 定向进化甘油脱氢酶 李梓君, 方柏山, 杨仲丽, 刘嘉 ( 华侨大学 工业生物技术福建省高等学校重点实验室, 福建 泉州 362021) 摘要: 经过连续易错聚合酶链式反应( ErrorPro ne P CR) 向克雷伯杆菌( K lebsiella p neumoniae) 甘油脱 氢酶 基因 中引入突变, 并构建突变文库. 依据突变体催化番红 O 显色的特性, 采 用琼脂平板 法和 96 微孔板法 相结 合的高通量筛选方法, 成功获得突变体 gldA74, 其酶 活力是亲本重组酶的 2. 73 倍. 通过 软件对突变 体 g ldA 74 酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比, 发现突变体 g ldA74 酶基 因发生了 一处点突变 ( A 964T ) , 该 突变 使一处氨基酸被取代. 将亲本重组酶和 进化酶的高效表达 产物经 N i 柱纯化后, 酶学性质的测 定结果表明, 甘 - 1 - 1 - 1 油的 K m 值 由 0. 58 mmol L 升 高至 0. 63 mmol L , 而 NA D 的 K m 值由 0. 74 mmo l L 升 高至 0. 77 mmol L - 1 , 并且酶的最适 pH 值由原来的 11. 5 升高至 12. 5, 而最适温度由 65 降至 55 . 关键词: 甘油脱氢酶; 克雷伯杆菌; 定向进化; 易错聚合酶链式反应 中图分类号: Q 554+ . 903 文献标识码: A 甘油脱氢酶( Gly cerol Dehydrog enase, GDH ) 主要催化甘油生 成二羟基丙酮 ( Dihy drox yacetone, DH A) . 根据催化反应中产物和电 子受体的不同, GDH 可分为 3 种类型[ 1] . 第 1 种为 依赖 NAD+ 的 GDH[ 2] ( EC1. 1. 1. 6) , 主要存在于各种细菌中, 如 A er obacter aerogenes , E scherichia coli , B acillus sub stilis 和 Cellulomonas sp . 等. 第 2 种为依赖 NADP+ 的 GDH ( EC1. 1. 1. 72 和 EC1. 1. 1. 56) , 大多存在 于霉菌和动物 组织 中[ 3] . 第 3 种 为不 依赖 辅酶 位于 细 胞膜 上 的 GDH , 在醋 酸 菌中 发 现存 在 这类 GDH[ 4] . GDH 的催化产物 DH A 因其分子中含 3 种官能团, 化学性质活泼, 广泛参 与聚合、缩合等反 应, 所以被广泛应用于轻工、医药和食品等行业[ 5] . 由于应用过程中常常需要酶在长时间内, 以及在极端 环境中保持较高活性, 所以需要对天然的甘油脱氢酶进行改造. 酶的定向进化是在体外模拟自然进化的 过程, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 通过人为地创造特殊的条件, 模拟自然进化机制( 随机突 变、重组和自然选择) , 在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶