酶的测定(详细).docVIP

一、脲酶测定(比色法) 1.方法原理 脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用。现介绍苯酚一次氯酸钠比色法，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 2.试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 （4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 （5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 3.操作步骤 取5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min后加10mL10％尿素溶液和20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀，37℃恒温箱中培养24h。过滤，取1mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行比色测定（为了消除土壤中原有的尿素而引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。）。 标准曲线配制：分别取0、l、3、5、7、9、11、13mL氮工作液，移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。随加随摇匀。20min后显色，定容。lh内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。 4.结果计算 以24h后lg土壤中NH3一N的质量(mg)表示脲酶活性(Ure)： Ure=a·V·n／m 式中：a为由标准曲线求得的NH3一N浓度(mg／mL)； V为显色液体积(50mL)； n为分取倍数； m为烘干土重(g)。 二. 过氧化氢酶测定(容量法)（比较好测） 1. 试剂配制 （1）0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释 （2）3N 硫酸：168ml浓硫酸定容于2L容量瓶 （3）0.1N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。 （4）草酸钠（标定1/5KMnO4）：105~110℃烘至恒重，称取0.2g（准至0.0001g），溶于100mL（8+92）硫酸溶液中。 2. 操作步骤 取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。（同时设置无土对照）。振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。 3. 结果计算 M=(V1-V2)*T/g M-活性值； V1-样品消耗的0.1N高锰酸钾溶液的ml数 V2-对照消耗的0.1N高锰酸钾溶液的ml数； T-0.1N高锰酸钾滴定矫正值； g-样品重 用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。 （A-B）×T即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。（就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量） 高锰酸钾溶液标定 用配制好的高锰酸钾溶液[c（KMnO4）=0.1mol/l]滴定基准草酸钠溶液，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。 高锰酸钾溶液标准浓度计算 c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700 式中??c（1/5KMnO4）=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；?m——草酸钠之质量，g； V1——高锰酸钾溶液之用量，mL； V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL； 0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。 三、蔗糖酶测定（比色法）： 1.方法原理 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶活性可以根据水解生成物与某些物质(如3，5一二硝基水杨酸或磷酸铜)生成的有色化合物含量来确定。现介绍3，5一二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5一二硝基水杨酸反应生成的黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性