Biacore X100简易操作指南.pdf

Biacore X100 简易操作指南 一、Biacore X100 设备介绍 分子相互作用分析系统Biacore 是由仪器主机和电脑两部分组成。 仪器开关在主机右后方，仪器正面左侧为缓冲液入口，可放置运行缓冲液，中上部分 为状态面板，以指示灯显示仪器状态，状态面板右边即为芯片的放置位置，芯片会与SPR 光学检测器、微流控系统IFC 嵌合，开展结合分析过程。右侧为样品舱，可放置15 个 1.5ml 的EP 管，下方放有废液瓶。如下图所示。 二、实验准备 实验前需根据实验需求选择芯片，GE 提供羧基葡聚糖表面的CM 系列芯片、适用于 HIS 标签蛋白的 NTA 芯片、应用于生物素标记分子的 SA 芯片 （通常用于核酸、多肽）等， 蛋白研究最常用CM5 芯片，开展实验时会固定一个分子（配体）在芯片表面，另一个分 子（分析物）以流动相流过芯片，通过表面等离子共振SPR 的原理研究相互作用的过程。 根据实验目的，需要确定配体的偶联量，可通过以下公式进行计算，其中Rmax 代表芯 片的最大结合容量，为分析物在表面的最大响应值，Sm 为化学计量比，LigandMW 为配体 的分子量，AnalyteMW 为分析物的分子量，R 代表配体的偶联水平，也即需要求得的值， L 实际固定量一般设为1.5R 。动力学分析中，R 需低于100RU。 L max Biacore 对分子的互作检测是基于功能性的，所以实验过程必须要新鲜有活性的样品， 0.22um 膜过滤或者仔细离心，配体纯度要求在 90% 以上，分析物的纯度依实验类型而定， 进行动力学/亲和力分析时需要 90% 以上的纯度，进行浓度/特异性测定时可以进混合样品。 缓冲体系选择：大多数缓冲液均适用，可根据样品活性确定最适缓冲液，须新鲜配制， 经0.22um 膜过滤及脱气。氨基偶联方法固定配体时，缓冲液中不能含有Tris 、甘氨酸等 带有伯胺基的物质。分析物溶液中，不能含甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质，如果样品 中含有该物质，可通过缓冲液置换、透析的方法除去。 三、实验操作 在该部分中，选用CM5 芯片，以配体mouse-anti-human β2-microglobulin antibody 和分 析物human β2-microglobulin 的动力学分析为例进行操作介绍（样品均来自Biacore getting started kit ），实验流程为配体固定-表面测试-再生条件筛选-分析物进样-芯片再生-数据分 析。 首先将缓冲液更换为实验所用缓冲液HBS-EP+，芯片更换为CM5 芯片，选择Tools- undock chip，填入芯片信息，按照芯片表面箭头所指方向，将芯片放入并合上舱门，点击 dock chip 。缓冲液、芯片放置完毕，选择Tools-prime 进行缓冲体系更换。 1、pH scouting ：在CM5 芯片上固定配体之前，需要筛选合适的配体缓冲液pH，使 配体通过静电吸附的作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果，通常会从pH5.5， 5.0，4.5 ，4 的10mM 醋酸钠中筛选，一般配体浓度为10-100ug/ml，初次实验可尝试 20ug/ml 。选择Assay flow-wizard，surface preparation-immobilization pH scouting，单击 New，可设置过程参数。首先选择芯片通道，可从1,2,3,4 通道任选一个，buffer 已经预置 四种条件，10mM 醋酸钠，pH5.5 , 5.0 , 4.5, 4，单击Next，输入配体名称mouse-anti- human β2-microglobulin antibody，contact time 180s，流速5ul/min，之后用50mM NaOH 再生表面，单击Next，可进行芯片表面温度和样品舱温度的设置，单击Next，左侧选择 sample and reagent rack1，按照样品架中对应位置放置溶液即可，点击Next 保存实验方法， 即可开始实验。 2、配体固定：配体在表面的偶联有直接偶联法和捕获法，本实验中使用氨基直接偶 联的方法进行固定。选择Assay flow-wizard，surface prepa