不同剂量的天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响.docVIP

　　不同剂量的天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响 作者：张艳琼，黄利鸣，李红军，吴江锋 【摘要】 目的探讨天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌Caski细胞生长的抑制作用及量-效关系。方法不同浓度TCS作用于体外培养人宫颈癌Caski细胞株，采用吖啶橙荧光染色，荧光显微镜观察TCS对Caski细胞的生长抑制作用；透射电镜和TUNEL检测法观察Caski细胞凋亡及TCS诱导Caski细胞凋亡的量效关系。结果TCS对Caski细胞的生长具有明显的抑制作用，透射电镜和TUNEL法证实该抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的。在一定浓度范围内，细胞凋亡数与TCS的浓度之间有剂量依赖性。结论TCS能诱导体外培养Caski细胞凋亡，最佳浓度为60 μg/ml。 【关键词】 天花粉蛋白； Caski细胞； 细胞凋亡 　　Abstract:ObjectiveTo study the inhibitory effect of different dose trichosanthin (TCS) on Caski cells. MethodsThe antiproliferative effect of different dose TCS on Caski cells icroscope. The TUNEL assay and electromicroscope easurement of apoptosis of different dose TCS on The Caski. Results The apoptosis of different dose TCS on Caski Cells acted as the antiproliferation. The quantity of the apoptosis of the Caski cells depended on TCS dose l. 　　Key 的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protEin，RIP)，迄今的研究发现TCS具有抗绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤、白血病和子宫颈腺癌等恶性肿瘤作用［1,2］。本实验旨在研究TCS对人子宫颈磷癌细胞的作用，并探讨其量-效关系，为TCS在抗宫颈癌的临床应用提供实验依据。 　 　1 材料与仪器 　　TCS购自上海金山制药厂（1.2 mg/ml）；RPMI-1640培养基购自Gibcol公司；10%新生牛血清购自杭州四季青公司；吖啶橙购自Sigma公司；DNasEI购自上海博亚生物技术有限公司；Triton X-100购自华美生物工程公司；DAB试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司；倒置显微镜和多功能显微镜及图像分析系统购自德国Leica；H-7500型透射电镜购自日立。 　 　2 方法 　　2.1 细胞培养人子宫颈鳞癌Caski细胞株( 中国 协和医科大学基础研究所生物物理教研室馈赠)，培养于5%CO2，37℃湿化孵箱中。培养基RPMI-1640中含10%新生牛血清，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L链霉素，所有实验均取对数生长期细胞。 　　2.2 倒置和荧光显微镜观察细胞的形态学变化体外培养的Caski细胞用PBS处理为阴性对照组、实验组分别用不同浓度（20,40，60，80，100 μg /ml）TCS处理24 h和48 h后，加入0.01%吖啶橙磷酸缓冲液（pH 6.0）50 μl，轻轻混匀，静置2 min后，于荧光显微镜下观察并记录图像。 　　2.3 透射 电子 显微镜观察实验组以60 μg /ml的TCS处理Caski细胞24 h和48 h，PBS处理为阴性对照组。2.5%戊二醛固定、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸钠硝酸铅双重染色后，倒置电镜下观察并拍照。 　　2.4 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测实验组用不同浓度（20,40,60,80,100 μg /ml）TCS处理Caski细胞24 h。按TUNEL试剂盒说明操作。用DNaseⅠ处理Caski为阳性对照，试剂2替代TUNEL反应混合溶液为阴性对照。凋亡细胞的判断：胞核棕黄色染色为阳性，阴性细胞不显色。 　　2.5 图像分析软件定量分析每一玻片任选10个视野， 计算 在200倍光镜下检测凋亡阳性细胞的个数、平均面积和平均灰度［3］。数据统计学分析用SPSS 10. 0统计软件（t检验）。 　 　3 结果 　　3.1 倒置显微镜下观察对照组细胞呈梭形，贴壁牢固、密集，折光性好，胞质饱满；实验组中经20 μg/ml TCS作用48 h后细胞间隔增大, 细胞体积缩小，胞浆凝缩，折光率增强，贴壁性差；60 μg/ml TCS浓度作用48 h脱落细胞数增