何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化.docVIP

　　何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化 【摘要】 　　目的建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性（SRAP）分子鉴定技术体系。方法正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量。结果 20 μl反应体系的优化组合为：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.4 mmol/L，引物0.35μmol/L，Taq酶1U。结论Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响，利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化。 .L.编辑。 【关键词】 何首乌 混伪品 序列相关扩增多态性 优化 　　Abstract：ObjectivEin order to characterize Polygonum multiflorum Thunb. and its adulterants, the SRAP molecular marker system ize the concentrations of Mg2+, dNTPs, primers and Taq DNA olymerase. ResultsThe optimum system of 20 μl mol/L, dNTPs 0.4 mmol/L, primer 0.35 μmol/L, Taq DNA polymerase 1 U. ConclusionThe concentrations of Mg2+, dNTPs, primers, Taq DNA olymerase have different effect in the result of SRAP-PCR in different species. It is necessary to optimize these four factors before using SRAP to identity different species. 　　Key multiflorum Thunb.; Adulterants; SRAP; Optimize 　　何首乌Polygonum multilorum Thunb.是我国传统名贵中药，广东十大“道地药材”之一。近年来对其药理药效研究及开发应用越来越广。据研究报道其药用化学成分主要有蒽醌类、二苯乙烯类、芪类、多糖类等［1～4］。何首乌具有降血脂［2］、增强免疫［3］、抗氧化［4］、护脑［5］等多种药效。除入药外，还被用于制取洗发水、首乌酒、保健品、食品和饲料添加剂等，开发前景十分广阔［6］。 　　然而，何首乌出现混伪品的 历史 久、地域广。本草中有混淆品宕芋的记载；河南、河北、甘肃、宁夏等地也有将翼蓼、毛脉蓼误做何首乌使用的历史［7］；湖北省武当山、竹山、竹溪、房县均有把混淆品耳叶牛皮消作何首乌使用的习惯［8］，且有不法商贩雕刻芭蕉块根为“人型何首乌”出售。混伪品的出现严重阻碍何首乌科研及应用，因此对何首乌及其混伪品的鉴定显得至关重要。 　　序列相关扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)以操作简单、稳定性高、多态性丰富、易于测序［9～12］等优点在种质鉴定［13］、遗传多样性分析［11］、遗传连锁图构建［14］、基因连锁标记寻找［9］与基因的遗传变异［14，15］等方面得到广泛应用。且Ferriol等［16］发现与其它分子标记相比，SRAP在分子水平上与传统在形态学水平上建立的物种分类鉴定更加吻合。 　　SRAP分子鉴定技术基于PCR反应。一个优化的PCR反应体系极其重要，这关乎样本DNA所能扩增的条带数、清晰度及稳定性，从而影响后续的统计分析。为建立何首乌及其混伪品SRAP分子鉴定技术，本文首次对何首乌及其混伪品SRAP-PCR反应体系的主要影响因素进行了优化，以期为何首乌及其混伪品鉴定提供前提条件。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料实验所用引物及物种见表1～2。实验所用DNA聚合酶，TaKaRa Taq (DR001AM)。BSA（牛血清白蛋白），购自TaKaRa。 　　表1 实验所用引物（略） 　　1.2 DNA提取用TIANGEN的DNAsecure Plant Kit提取经硅胶干燥保存的各物种叶片DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量合格，稀释为50 ng/μl，-20℃保存。 　　表2 实验所用物种（略） 　　1.3 SRAP-PCR扩增采用L16 (45 )正交实验设计，对总体积为20μl的SRAP反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行4因素4水平的优化分析(表3～4)，共16个处理。其它成分为：DNA模板（50 ng/）1 μl、B