何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响.docVIP

　　何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响 作者：陈雪 牛嗣云 曲银娥 李亚丽 高福禄 【摘要】 目的研究中药何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖及凋亡的影响。方法50只SD大鼠随机分为5组：阴性对照组，模型组，何首乌饮高、中、低剂量组，每组10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老大鼠模型。采用SP免疫组化法和原位末端标记法( TUNEL法)分别检测肾脏组织PA和凋亡的表达情况。结果①模型组大鼠肾脏PA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠(Plt;0.05)。何首乌饮各剂量组PA阳性细胞数高于模型组(Plt;0.05)。②模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组大鼠(Plt;0.05)。何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组(Plt;0.05)。结论何首乌饮可明显提高衰老大鼠肾脏的增殖能力并抑制其凋亡，具有一定的延缓衰老作用。 【关键词】 何首乌饮 衰老 肾脏 增殖细胞核抗原 细胞凋亡 研究发现在组织器官发育、完善的过程中细胞增殖不但总是与细胞凋亡相伴随［1］，而且机体的衰老过程与两者的关系亦密不可分。本实验应用免疫组织化学技术和原位末端标记法( TUNEL)分别检测肾脏PA阳性细胞和凋亡细胞在D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肾脏的表达情况，阐明何首乌饮对衰老肾脏的影响，为研究衰老机制及开发临床抗衰老药物提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品、试剂和实验动物何首乌饮方剂购自承德市肛肠 医院 ；D-半乳糖购于北京化学试剂公司；PA购自中杉金桥生物试剂公司；TUNEL试剂盒购自Roche生物试剂公司。清洁级8周龄雄性SD大鼠，体重180～220 g，购自河北医科大学实验动物学部，动物合格证号：605106。 　　1.2 何首乌饮药物溶液的制备何首乌饮方剂组成:何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓按质量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，过滤后浓缩至含生药分别为0.75，1.5，3.0 g·ml-1（分别作为低、中、高剂量药液）。4 ℃保存，给药前复温至25～30 ℃。 　　1.3 造模及实验分组50只SD大鼠随机分成阴性对照组、模型组、何首乌饮低、中、高剂量组（10，20，40 g·kg-1·d-1），每组10只。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水，其余4组大鼠腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg-1(用生理盐水配制成6%的溶液)，连续60 d，制备亚急性衰老大鼠模型［2］。给药组在造模第1日起同时每天一次灌胃何首乌饮，连续60 d；阴性对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水。 　　1.4 检测方法 　　1.4.1 采用免疫组织化学S-P法按照免疫组化常规步骤操作。石蜡切片的抗原修复采用pH6.0的柠檬酸抗原修复液，加热至沸腾后5 min缓慢冷却；PA (抗体稀释比1 ∶200)4℃过夜。以PBS替代一抗作为阴性对照。 　　1.4.2 原位末端标记法( TUNEL染色法)将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，切片常规脱蜡至水， 各步骤按TUNEL 试剂盒操作，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。以不含末端脱氧核苷酸转移酶的液体代替TUNEL 混合液作阴性对照。 　　1.4.3 结果判定PA及TUNEL染色标本细胞胞核染成棕黄色粗颗粒为阳性反应细胞。在显微镜(400×)下，每张切片上随机选取10个视野，计数阳性细胞，每组计数3只动物，每个标本计数3张切片， 计算 每个视野的平均阳性细胞数。 　　1.4.4 数据处理Excel建立数据库，SPSS13.0软件分析，单因素方差分析比较组间差异。 　　2 结果 　　2.1 免疫组化染色结果各组切片均可见PA染色，免疫阳性产物位于细胞核，通常呈棕黄色颗粒状，小部分呈弥散状。免疫阳性细胞主要分布于肾小管，肾小球有少量表达。模型组大鼠肾脏PA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠，何首乌饮各剂量组PA阳性细胞数高于模型组，差异均有统计学意义。见表1。 　　2.2 TUNEL染色结果TUNEL阳性细胞主要表达在肾小管上皮细胞，肾小球仅有少量表达。模型组大鼠中凋亡细胞成簇存在，而在用药组散在分布。模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组，何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组，差异均有统计学意义。见表1。 　　表1 各组大鼠肾脏PA和TUNEL结果比较（略） 　　与阴性对照组比较，▼Plt;0.05；与模型组比较，▲Plt;0.05；n=9 　　2.3 PA和TUNEL的相互关系经相关分析PA和TUNEL具有负相关关系（r=-0.912，P=0.000）。 　　3 讨论 　　近年来延缓衰老以及老年病的预防已成为国内外研究的焦点，寻找有效的抗衰老药物是衰老研究中的一个重要方面。由于化