去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化.docVIP

　　去卵巢大鼠海马及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽含量的变化 作者：高飞 宋士军 胡进中 李芳芳 张若楠 【摘要】 目的 观察雌激素缺乏对大鼠海马CA1/CA2区及额叶皮层海马胆碱能神经刺激肽（HP）含量的影响。方法 选取清洁级4月龄雌性SD大鼠30只，随机分为3组：假手术组（Sham组）、去卵巢组（OVX组）和去卵巢加雌二醇（E2）组（OVX+E2组），每组10只。除Sham组做假性手术外，其余2组均行双侧卵巢切除术；OVX+E2组去卵巢手术10 d后给予E2皮下注射，100 μg/kg，隔日1次。去卵巢手术后常规喂养4个月，获取组织标本，用于组织蛋白和组织总RNA的提取。用ethods Thirty female clean SD rats aged 4 months ly divided into sham, OVX, OVX and estradiol (OVX+E) groups, and ten rats per group. Sham group e adipose tissue above ovaries, OVX group y. Postoperative rats ethod and then sacrificed 4 months later to obtain tissues and specimen for the use of the extraction of tissues’ protEin and total RNA.The relative protEIn contents of CHPpp and NHPpp easured by ilipore公司）；HPpp氨基末端抗体（NHPpp Ab）、HPpp羧基末端抗体（CHPpp Ab）、βactin抗体、免疫印迹发光染料(ECL)（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥公司）；β巯基乙醇（美国Promega公司）；Taq DNA聚合酶（美国Fermentas公司）；dNTP（北京鼎国生物公司）；反转录试剂盒（美国Fermentas公司）；HPpp mRNA、βactin引物（上海生工公司）。其余试剂均为国产优级纯或分析纯。 1.3 仪器设备 DYYⅡ型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；20PR52D型低温高速离心机（日本日立公司）；PTC200型PCR热循环仪（美国MJ Research）；JEDA801E 型捷达凝胶成像仪（江苏捷达软件公司）。 1.4 组织标本的采取及指标测定 用戊巴比妥钠(36 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，剪开头皮，用止血钳沿大鼠头颅中央骨缝撬开，迅速分离脑组织，剥取海马，同时刮除腹侧齿状回和CA3区，剥取额叶皮层，立即将海马背侧组织(CA1/CA2)及额叶皮层置液氮中，于 -80℃低温冰箱保存，用于组织蛋白和组织mRNA的提取。分离大鼠子宫并进行称重。 1.5 组织蛋白的提取 取大鼠海马背侧组织及额叶皮层各约50 mg，加入预冷的蛋白匀浆液0.5 ml，在冰浴中匀浆5 min，4℃ 离心10 000 r/min离心30 min，取上清，Bradford法测定蛋白含量。 1.6 HPpp蛋白的测定 采用in。取膜TBS冲洗。用TBS配制5%脱脂奶粉，室温封闭4 h。用5% 的BSA按比例稀释一抗(CHPpp 1∶1 500；NHPpp 1∶1 500；βactin 1∶2 000)，向膜的正面滴加一抗，4℃ 过夜(防止液体蒸发)。回收一抗后，用0.05% Tin。用5%的BSA按1∶6 000稀释二抗，滴加二抗，室温静置2 h。用0.05% Tin，最后用TBS洗膜5 min，在暗室滴加ECL试剂反应3 min，保鲜膜包裹置于暗盒中进行X光胶片曝光、显影和定影。用凝胶成像分析仪采集图像并用软件进行分析。βactin作为内参照。 1.7 HP mRNA表达的测定 用Trizol法提取总RNA。将含1.0 μg RNA的水溶液和随机引物置于0.2 ml的微量离心管中，70℃变性5 min，立即置于冰水浴中。加入反应体系中的其他成分混匀，25℃ 15 min，42℃孵育60 min，70℃ 10 min，置冰水浴冷却，得到cDNA，-20℃保存备用。PCR引物序列如下：HPpp（基因文库：NM_017236）：上游：5′ACTACGGCGGAGTAACGG3′，下游：5′GCTTGGGCACAGAGTCATC3′，长度456 bp；βactin（基因文库:NM_031144）：上游：5′GCCATGTACGTAGCCATCCA3′，下游：5′GAACCGCTCATTGCCGAT