当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响.docVIP

　　当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响 作者：陈鹊汀，刘智勤，朱惠学，王海波，李中 【摘要】 目的观察当归补血汤对环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，随机分为4组，荷瘤对照组、CTX组、当归补血汤＋CTX组及当归补血汤组。造模次日开始给药，共10 d，停药次日处死，测定脾脏和胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性、T淋巴细胞增殖能力。结果当归补血汤可提高化疗荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性，同时还对刀豆素A（ConA）诱导的T淋巴细胞增殖有促进作用。结论当归补血汤具有提高机体免疫功能，抵御化疗所引起的免疫功能下降的作用。 【关键词】 当归补血汤； 肿瘤； 免疫功能； 化疗 当归补血汤方出自李东垣《内外伤辩惑论·暑伤胃气论》，为气血双补之经典名方。研究表明，此方具有增强免疫的效果［1］。但有关当归补血汤对化疗荷瘤小鼠免疫系统的影响报道较少，我们通过建立S180荷瘤小鼠模型，观察了当归补血汤对环磷酰胺（cyclophosphamide ，CTX）化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响，旨在为该方的临床应用提供一定实验依据。 　 　1 材料与仪器 　　1.1 动物及细胞株 　　清洁级昆明小鼠，7～9周龄，雌雄各半，体质量18～22g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证：SCXK(冀)2003-1-003。动物在实验前适应性驯养1周。饲料和垫料由河北医科大学实验动物中心提供。实验期间自由采食饮水。腹水型S180瘤株由河北医科大学实验动物中心提供，L929细胞株由北京市中医研究所提供。 　　1.2 药品 　 　　当归补血汤由黄芪和当归组成（饮片由河北大学附属 医院 中药房提供，所有药品均经中药专家鉴定），将上述药物加水浸泡20min后，煎煮3次，约30min/次，3煎溶液混合过滤，取汁300ml，离心取上清，80℃水浴浓缩至每毫升含生药1.2g，分装，高温消毒后置于4℃冰箱保存备用。化疗药物：注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司(批号。 　　1.3 试剂及仪器 　　DMSO(Amresco公司产品)，四氮甲唑蓝(MTT，Amresco公司产品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司产品)，RPMI-1640完全培养基(Amresco公司产品)。酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司产品），CO2培养箱（上海福玛实验设备有限公司产品），超净工作台(苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司产品)，倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司产品）。 　　 2 方法 　　2.1 动物模型的建立［2］ 　　无菌条件下抽取6～7 d生长良好的S180小鼠的腹水，按1∶3比例用生理盐水稀释，反复冲打，充分混匀，在显微镜下计数，用生理盐水调整细胞浓度为1.5×107/ml，取0.2ml于每只小鼠右侧腋窝下碘酊消毒后皮下接种。瘤株接种前，均用0.2%台盼蓝染色， 计算 活细胞数为95%～98%。从抽取腹水时开始，到移植完最后1只小鼠的总时间控制在1 h内。 　　2.2 分组及给药 　　小鼠接种24 h后按体质量和性别随机分成荷瘤对照组、CTX组、当归补血汤+CTX组和当归补血汤组。荷瘤对照组均用生理盐水灌胃，同时腹腔注射生理盐水，单纯化疗组腹腔注射CTX 0.02 g·kg-1·d-1，同时用生理盐水灌胃，当归补血汤+CTX组腹腔注射CTX 0.02 g·kg-1·d-1，同时用当归补血汤12g·kg-1·d-1（按生药量计算，剂量由预实验得出）灌胃，当归补血汤组用当归补血汤12 g·kg-1·d-1灌胃，同时腹腔注射生理盐水，各组灌胃容积均为0.4 ml/只，腹腔注射容积均为0.2 ml/只，各组于瘤细胞接种第2日开始用药，1次/d，连续10 d。 　　2.3 脾脏、胸腺指数 　　小鼠脱臼处死，以无菌操作取下脾脏、胸腺， 电子 天平称质量并计算脏器指数。 　　2.4 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定［3］ 　　小鼠脱臼处死，75%酒精中浸泡2 min，置超净台。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10 ml，轻揉腹部2 min，回抽腹腔液，离心弃上清。RPM1－1640培养液洗两次，计数并调节细胞浓度为2×106个/ml，加入96孔培养板，每孔100 μl，每样本均设3个复孔。37℃，5%CO2培养箱培养4 h，温PBS液洗并吸出未贴壁细胞，得到巨噬细胞单层。于每孔中加入0.03%的中性红溶液100μl，置CO2培养箱培养1 h，用温PBS液反复冲洗未被吞噬的中性红3次。于每孔中加入细胞裂解液（1∶1的冰醋酸和无水乙醇)100 μl，4℃静置过夜，用酶标仪在570nm处测定OD值。 　　2.5 NK细胞活性测定［4］ 　　无菌