快速液相色谱法与常规高效液相色谱法测定克林霉素磷酸酯及有关物质的比较.docVIP

　　快速液相色谱法与常规高效液相色谱法测定克林霉素磷酸酯及有关物质的比较 作者：张斗胜 李进 许明哲 王晨 姚蕾 相秉仁 胡昌勤 【摘要】 目的 比较分析快速液相色谱法(UFLC)与常规液相色谱法(HPLC)测定克林霉素磷酸酯含量及有关物质。 方法 UFLC法色谱柱采用ethods UFLC: a 20A检测器经改装适应快速分离，LC Solution色谱工作站)与illinium 2.3色谱工作站)。克林霉素磷酸酯对照品(批号130486200502，含量79.0%)，克林霉素对照品(批号130422200402，含量86.5%)，林可霉素对照品(批号130432200407，含量86.2%)；克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液均由 中国 药品生物制品检定所提供。磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯，水为双蒸水，乙腈、甲醇为色谱纯。 2 方法与结果 2.1 供试品溶液与对照品溶液的制备 (1)供试品溶液 取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液用??动相稀释成0.3mg/ml的溶液，分别称为溶液(A)和溶液(B)。另取上述两供试品溶液同法稀释成3.0mg/ml的溶液，作有关物质分析供试液。 (2)对照品溶液 分别取克林霉素磷酸酯、克林霉素和林可霉素对照品适量，精密称定；加流动相溶解定量稀释制成含上述三种对照品各约0.3mg/ml的混合溶液。 2.2 实验方法 参考 UFLC法常规HPLC法线性范围(mg/ml)0.01～2.50.01～2.0回归方程 Y=2.56908×105X-620.86 r=0.9999Y=7.0×106X r=0.9954最低定量限(ng)60400最低检测限(ng)20100 精密度 取对照品溶液2μl注入高效相色谱仪，重复进样5次，RSD为0.41%。 重复性和溶液稳定性 取供试品溶液(A)2μl注入高效相色谱仪，重复进样5次，平均含量为104.5%，RSD为1.7%。另取供试品溶液(A)、(B)分别在室温放置24h后测定。24h后主峰峰面积减失百分率lt;2%，结果表明供试品溶液在24h内较稳定。 2.4 样品测定 分别取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化钠注射液各8批，每批样品平行分成2份，分别用UFLC法和常规HPLC法测定，外标法 计算 含量。结果进行配对t检验［7］，统计分析见表2。 由表2可知，两方法测定克林霉素磷酸酯葡萄糖(氯化钠)注射液的含量结果无显著性差异。 2.5 有关物质测定 分别采用UFLC法和常规HPLC法测定，以主成分自身对照法计算有关物质。UFLC法与常规方法测得的有关物质典型色谱图见图2。 从图2可知，UFLC法可检出7个杂质峰，2号峰似融合峰，4、5、6号峰间的分离度不好；常规HPLC法表2 两种克林霉素磷酸酯注射液的含测结果表3结果显示，两方法测定的结果相近。 3 讨论 (1)UFLC方法的确定 本UFLC方法由标准方法经简单方法转换而来。由于UFLC液相系统的压力界于常压与超高压液相系统之间(345～485bar)，色谱柱采用短、细粒径的ODS杂化柱，因此方法转换中对样品预处理方法、色谱流动相、流速和进样体积需要重点考虑。实验中采用0.22μm的滤膜过滤样品及流动相可以更有效除去杂质对系统及色谱柱的污染，保持系统的稳定。由于分析时间、柱分析效能及系统载压三方面因素彼此相互影响且相互制约，因此寻找适合三方面要求的最佳实验条件是实现快速分析的关键。本文根据色谱有关理论［8］，对流速、进样体积进行了优化。考察流速在1.0～3.0ml/min范围内主峰的保留时间与系统压力变化的关系，发现当流速为1.5ml/min时，tR已提前至4min左右，继续增加流速虽然保留时间减小，但系统压力显著上升；流速为2.0ml/min时，系统压力已接近(485bar)。含量测定中，不同进样体积对主峰的拖尾因子(T)和理论板数(N)的影响见表4。可见，1、2μl进样量测定的峰型对称、柱效较高；但当进样量减至1μl，虽然峰型和柱效较高，但结果准确性变差，连续进样的RSDgt;2%；增加进样量，色谱峰形逐渐变差，柱效下降；且过大进样量易造成色谱柱过载，影响分析的准确性和稳定性。综合上述表3 克林霉素磷酸注射液有关物质结果分析 表4 不同进样体积的系统色谱参数分析，确定最佳流速为1.5ml/min，进样体积为2μl。 (2)UFLC分析的特点 比较UFLC法与常规HPLC法分析测定克林霉素磷酸酯含量及有关物质结果，发现UFLC法测定克林霉素磷酸酯不仅准确，而且比常规方法［5，6］更快速、灵敏，特别适合于对克林霉素磷酸酯含量的快速测定，在工作量较大的检测项目如制剂含量、含量均匀度及溶