有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表达的影响.docVIP

　　有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表达的影响 【摘要】 目的 探讨有氧运动对衰老模型大鼠心肌细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表达的影响。方法 建立衰老大鼠模型，随机分为对照组和两组运动组，运动组分别给予6次/in，训练12 g/kg，青年组腹部注射相同剂量的生理盐水。连续注射42 d。青年组、自然衰老组和单纯模型组（随机选取模型组8只）禁食12 h后处死，取左心室游离壁全层心肌组织，TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，判断造模是否成功〔3，4〕。 1.3 造模后分组及运动训练 造模成功后，衰老模型SD大鼠随机分为3组，为对照组，3次/in，水温31℃～33℃，水深60 cm，人工控制大鼠不停地游泳。对照组放入同样温度的浅水中，以避免水温对大鼠产生的刺激差异，第1天游泳时间为30 min，以后每天增加10 min，直至达到90 min后，保持不变。每次训练结束后，动物能自己抖干身上的水，无疲劳症状出现，共训练12 ersham Biosciences) 。 1.4.2 标本收集 末次运动后48 h，断颈处死大鼠。 取左心室前壁全层心肌组织，分为两份，一份即刻 存至-70℃冰箱，用作免疫印迹检测；一份用4%多聚甲醛固定 24 h后蔗糖沉淀过夜，取左心室近心尖处心肌组织作10 μm厚冰冻切片，每个标本取两张不连续切片，用作TUNEL检测。 1.4.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 新鲜配制3%双氧水室温处理标本片10 min，取TDT和DIGdUTP各1 μl加入18 μl标记缓冲液滴加于切片，37℃标记2 h；封闭液封闭室温30min，生物素化抗地高辛抗体37℃反应30min；SABC稀释液反应30min，DAB显色， 苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡阳性细胞核呈棕黄色。每只大鼠观察两张切片，每张切片计数5个高倍视野(×400)中的凋亡阳性细胞数。凋亡指数（apoptosis index，AI）＝凋亡阳性细胞数/总细胞数。 1.4.4 免疫印迹法检测心肌组织中Bax 、Bcl2的表达 ①蛋白样品的制备：取冻存的心肌标本100 mg， 加裂解液1 ml及PMSF，protease inhibitor cocktail，phosphatase inhibitor cocktail各10 μl，冰上匀浆30 min， 4℃ 12 000 r/min离心15 min,取上清，测定蛋白浓度后与等体积2×上样缓冲液混匀后煮沸3 min，-20℃保存以备用。②免疫印迹：按照实验室常规方法配制10%SDSPAGE，以总蛋白量30 μg/lane上样，电泳；转膜，以1∶400鼠抗bax单克隆抗体或1∶400鼠抗Bcl2单克隆抗体及1∶5 000辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG孵育， 用ECL发光剂显示阳性条带,在Ty2phoon分子成像系统上记录结果。以βactin为内参照，目标蛋白条带及βactin条带为同次电泳所得，以两者的比值进行半定量。 1.5 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件，实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理。 2 结 果 2.1 衰老模型制备的结果 TUNEL染色结果显示，青年组心肌细胞AI(4.132±0.308)‰， 自然 衰老组心肌细胞AI〔(33.692±2.667)‰〕及单纯模型组〔(34.146±2.931)‰〕较青年组明显增多(P＜0.01)，而自然衰老组与单纯模型组无明显差异。见图1。 2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡和Bcl2、Bax检测结果 与对照组相比，两组运动组心肌细胞AI均显著降低（P＜0.01），Bcl2显著升高（P＜0.01），Bax降低（P＜0.05），Bcl2/Bax显著升高（P＜0.01）；与6次/yeloid cell leukemia1)、CED9等;二是促细胞死亡的,主要包括Bax、Bak、BclXS、Bad、Bik、Bid等。其中Bax和Bcl2是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一对功能基因,Bcl2和Bax蛋白水平高低与凋亡调控直接相关：Bax增高，促进细胞凋亡；Bcl2增高，抑制细胞凋亡。Bcl2/Bax比值是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素〔6〕。 心肌细胞属终末分化细胞,是一种不具备增殖能力的成熟细胞。心肌细胞凋亡,必然导致心肌细胞数量减少,心脏功能下降,进而从生理代偿向病理 发展 转变，也就是说心肌细胞过度凋亡加速心脏衰老。有研究证实运动可以通过调节Bcl2/Bax的比值影响心肌细胞凋亡。金其贯等〔7〕研究表明过度训练可使Bcl  2 蛋白表达下降，心肌细胞凋亡增加。沈志祥〔8〕等在研究运动对老年小鼠心肌Bcl2、Bax