氟尿嘧啶影响人大肠癌细胞增殖及凋亡的分子机制.docVIP

　　氟尿嘧啶影响人大肠癌细胞增殖及凋亡的分子机制 作者：刘永年 王索安 赵明 张伟 赵海龙 李菊英 【摘要】 目的 研究 氟尿嘧啶(5-Fluorouracial,5－FU)体外 影响 人大肠癌Lovo细胞增殖抑制及诱导凋亡的分子机制。 方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)显色法，检测不同浓度5－FU作用不同时间对Lovo细胞生长所产生的不同影响；光镜观察凋亡细胞的形态特点；流式细胞术( FCM)检测凋亡细胞百分率；琼脂凝胶电泳、免疫组化SP法检测 Lovo细胞增殖核抗原Ki－67及凋亡相关基因蛋白p53、Fas表达水平。结果 5－FU能抑制 Lovo细胞生长，在一定剂量和时间范围内，通过光镜观察，见凋亡细胞明显增多，经5－FU诱导后，用FCM 分析 Lovo细胞，发现凋亡百分率增加并显示剂量和时间效应。实验组细胞Ki－67表达明显低于对照组，Fas表达明显升高，而P53在诱导前后均无表达。结论 5－FU能诱导Lovo细胞凋亡并抑制其增殖及侵袭性，Fas基因激活可能是触发Lovo细胞凋亡的主要机制。 【关键词】 氟脲嘧啶 大肠癌 细胞凋亡 流式细胞术 琼脂凝胶电泳 A MOLECULAR MECHANISM FOR EFFECTS OF Abstract Objective To study the molecular mechanism for 5-Fluorouracial(5-FU) and clarify atography is adopted to test effects of 5-FU of different concentration and at different time of reaction over groechanical method used to observe configuration and characteristics of apoptosis cells; FCM employed to test the percentage of apoptosis cells; electrophoresis and immunized grouping SP applied to test antigen Ki-67 of Lovo cells proliferation and expression of P53 and Fas geic protEins in relation to apoptosis. Results 5-FU inhibits groited dosage and period of time, there has been an obvious increase in apoptosis cells under the photomechanical scope; the analysis of Lovo cells by FCM shoe effects. Electrophoresis . In the project group, Ki-67 expression in cells is clearly loight be the primary mechanism of triggering Lovo cells to apoptosis. Key a公司产品。用前加双抗、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)］。小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品。0.25%胰酶、0.02íTA、Hanks液、3.7%NaHCO3等试剂自配。CO2培养箱（NATURE，USA）， 倒置相差显微镜（Olympus CKX,Japan）。 1.1.2 方法 ：（1）细胞复苏：将冻存在离心管内的Lovo细胞用37℃水浴解冻。吸出细胞悬液,装入另一支离心管中,加入含15%小牛血清的1640培养液（pH7.2），吹打混匀后离心（1000r/min，5min），吸去冻存液。（2）细胞培养：复苏细胞加入含15%小牛血清的1640培养液充分混匀，使其浓度为5×104个/ mL，接种于培养瓶中。置孵箱(37 ℃，5% CO2)内培养。（3）细胞转代(倒置显微镜下观察):培养瓶内细胞长满单层后弃掉培养液。加入适量0.25%胰酶液（覆盖瓶底），置37 ℃环境中消化1～2 min。观察到细胞收缩并出现裂隙后终止胰酶反应。加入适量的Hanks液轻轻洗一遍后加入含15%小牛血清的1640液5 mL吹打制成细胞悬液，按5×104个/mL浓度接种培养。 1.2 细胞增殖抑制试验（MTT还原法） 1.2.1 材料：氟脲嘧啶（Fluorouracil），分子量130.08，使用前用培养基液稀释到所需浓度。噻唑蓝(MTT)为sigma公司产品，用无血清1640培养液配