氧化修饰蛋白质在帕金森病发病机制中的作用.docVIP

　　氧化修饰蛋白质在帕金森病发病机制中的作用 作者：张颖 杨艺敏 白晶 常明 许志军 胡林森 【摘要】 目的 从氧化修饰蛋白质的角度探讨帕金森病（PD）的发病机制。方法 本实验分为实验组(PD细胞模型组) 和对照组。PC12细胞孵育24 h后，实验组加入以DMSO溶解的终浓度10 μmol/L的蛋白酶体抑制剂(PSI)，对照组加入DMSO，继续孵育24 h后进行观察。MTT法检测细胞存活率，HE染色观察细胞内包涵体的形成。采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与EM培养基购自Gibco公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品厂生产。荧光倒置相差显微镜为日本Olympus产品。DNP购自东京化成 工业 株式会社，一抗购自Molecular Probe公司，二抗、显色液等购自Sigma公司。硝纤膜、试剂盒、固相pH值梯度（IPG）胶条等均购自Amersham Biosciences公司。聚焦仪、电泳系统、凝胶图像扫描仪、2D Evolution分析软件和质谱仪为Amersham Biosciences公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PD细胞模型的建立 　　PC12细胞复苏后，以2×105/ml的密度接种于底面积25 cm2的塑料培养瓶，于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。2～3 d更换1次培养液。选取对数生长期细胞进行传代。细胞以1×105/ml密度接种于底面积25 cm2的培养瓶。24 h后更换培养液，实验组加入终浓度10 μmol/L的蛋白酶体抑制剂(PSI)，以二甲基亚砜(DMSO)溶解，对照组加入DMSO，DMSO终浓度均为0.1%，继续孵育24 h后收集两组细胞用于实验。噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率；苏木素伊红（HE）染色观察细胞内包涵体的形成。 　　1.2.2 提取细胞总蛋白 　　倾去培养液，以冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次， 计算 细胞重量。按重量比1∶10加入裂解液，室温作用1 h。25 000 r/min，离心30 min，收集上清。应用Cleanup试剂盒去除杂质，二维度（2D）定量试剂盒进行蛋白质定量（浓度控制在5～10 mg/ml）。 　　1.2.3 一向等电聚焦电泳及DNP衍生 　　240 μg样品与一向电泳缓冲液混合后均匀加入胶条槽，IPG胶条胶面朝下放入胶条槽，在电泳仪上进行水化及等电聚焦电泳。而后将IPG胶条在含20 mmol/L DNP的2N的HCl溶液中室温孵育20 min，而后在含30%甘油的2 mol/L TrisBase溶液中洗15 min。 　　1.2.4 二向凝胶电泳 　　将平衡后的IPG胶条转移至12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）(16 cm×15 cm×1.0 mm)上端，在垂直电泳仪上进行二向电泳。待溴酚蓝距底边约4 cm时停止电泳。 　　1.2.5 分析胶进行aster 2D Evolution软件进行分析，在制备胶上找到与Western印迹结果相匹配的蛋白点。对照组不存在而实验组存在的蛋白点进一步做质谱鉴定。 　　 2 结 果 　　2.1 细胞模型结果 　　10 μmol/L PSI作用PC12细胞24 h的情况下，细胞存活率降至85.46%±1.75%(对照组设为100％)，与对照组比较差异显著（Plt;0.05）；并且细胞多数处于包涵体形成阶段，较好地模拟PD的两大基本病理特征，即神经元丧失和神经元内嗜酸性包涵体的形成。因此，10 μmol/L PSI作用24 h的PC12细胞可作为研究PD发病机制及PD药物 治疗 的可靠模型。见图1。 对照组（图1A）PC12细胞胞浆嗜酸性染色，胞核嗜碱性染色。实验组（见图1B）PC12细胞体积增大，胞浆内出现嗜酸性包涵体（实心箭头所示），胞核嗜碱性染色(空心箭头所示) 图1 HE染色结果(×200) 　　2.2 蛋白质鉴定结果 　　扫描考染的制备胶及，Thongboonkerd V,et al.Proteomic identification of oxidatively modified protEIns in Alzheimer′s disease brain.Part Ⅱ：dihydropyrimidinaserelated protein 2，alphaenolase and heat shock cognate 71〔J〕.J Neurochem，2002;82(6):152432. 　　3 Pickart CM.Mechanisms underlying ubiquitination〔J〕.Annu Rev Biochem,2001；70:50333. 　　4 Rideout HJ，Larsen KE，Sulzer D,et al.Proteasom