氨茶碱对哮喘呼吸道重塑大鼠支气管组织中Bcl2及Bax蛋白含量的影响.docVIP

　　氨茶碱对哮喘呼吸道重塑大鼠支气管组织中Bcl2及Bax蛋白含量的影响 作者：段旭东 赵辉 王晓红 于文涛 王晓媛 张雅兰 【摘要】 　　　目的 观察氨茶碱对支气管哮喘呼吸道重塑大鼠呼吸道形态学及气管周围组织中凋亡相关蛋白Bcl2及Bax含量的影响。方法 SD大鼠随机分为正常组、模型组、 治疗 组，每组8只，除正常组外以卵蛋白致敏并吸入激发法制备大鼠哮喘模型，治疗组、模型组从第1次哮喘激发开始（造模第15天）分别给予氨茶碱0.035 g·kg-1·d-1、生理盐水2 ml/d灌胃给药，用药4 g，10 ml/支。 　　1.3 主要仪器及试剂 　　彩云Ja公司产品。氢氧化铝：天津市化学试剂三厂生产，分析纯。NDY1000彩色病理图像分析仪：武汉同济医科大学千屏影像科技公司生产。BH2光学显微镜：Olympus公司生产。 　　1.4 动物分组及给药 　　实验大鼠按随机表分为正常组、模型组、氨茶碱治疗组（简称治疗组），每组8只。治疗组从第1次哮喘激发开始灌胃给药，直至处死，2 ml每日1次，用药剂量按有关公式〔2〕，将人临床用药剂量折算为大鼠用药剂量，模型组、正常组均以2 ml生理盐水代替氨茶碱，每日1次灌胃。 　　1.5 模型建立 　　实验组参照〔3〕，分别于第1天及第8天大鼠腹腔内注射新鲜配制的卵蛋白溶液1 ml（内含卵蛋白100 mg，氢氧化铝100 mg）致敏，第15天起哮喘模型组、治疗组开始雾化吸入1%卵蛋白激发哮喘，雾化流量5 ml/min，隔日1次，每次20 min，共4 l/kg腹腔内注射麻醉，麻醉完全后开胸，迅速结扎右主支气管，取右肺中叶，4℃ 4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片。HE染色,镜下观察病 理学 改变。采用NDY1000型图像分析仪测量大鼠气道壁面积、支气管平滑肌的面积，用完整支气管管腔的内周长（Pi）进行标准化。 　　1.6.2 支气管上皮及其周围组织中Bcl2、Bax含量测定 　　石蜡切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水，磷酸缓冲液（PBS）漂洗5 min×2次；3%的双氧水甲醇溶液室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗涤3次；将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次，冷却后PBS洗涤2次，滴加5%正常山羊血清封闭，室温孵育20 min。倾去多余液体，滴加Bcl2和BaxⅠ抗（1∶100稀释）湿盒孵育，4℃冰箱内过夜，PBS洗涤5 min× 2次；滴加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育45 min，PBS 洗涤5 min×2次；滴加试剂过氧化物酶（SABC）（1∶100稀释）,37℃孵育20 min，PBS洗涤5 min×2次；二氨基联苯胺（DAB）显色5～15 min，终止呈色反应；苏木素衬染，常规裱片、干燥、脱水、透明、封片。光学显微镜下，Bcl2和Bax蛋白染色呈棕黄色颗粒。Bcl2蛋白测定：每张切片高倍镜下（×400）由同一观察者选取支气管上皮四周及左上共5个视野， 计算 机图像处理软件半定量测定支气管Bcl2含量（以染色吸光度值表示）。Bax蛋白测定：每张切片高倍镜下（×400）由同一观察者选取支气管壁四周及左上共5个视野，计算机图像处理软件半定量测定支气管Bcl2含量（以染色吸光度值表示）。 　　1.7 统计学处理 　　数据采用x±s表示，用Stata8.0统计软件处理，统计方法采用单因素方差分析及t检验。 　 　2 结 果 　　2.1 支气管面积、支气管平滑肌面积的变化 　　与正常组相比，哮喘激发4 g/L，理论上给予0.5 mg/kg氨茶碱可使血清药物浓度上升1 mg/L，其治疗剂量与中毒剂量十分接近，20 mg/L血药浓度即可出现中毒反应，血清药物浓度大于35 mg/l时可引起呼吸急促??惊厥甚至死亡〔6〕。本实验中原设置的高剂量氨茶碱（70 mg/kg）组实验动物，用药后呼吸兴奋、惊厥等中毒反应明显，并有数只在实验过程中死亡，无法进行统计处理。 综上所述，氨茶碱具有较好的抑制支气管哮喘气道重塑的作用，其作用提高支气管上皮及支气管壁肺组织中Bcl2、Bax含量，减少气道上皮细胞的损伤，促进支气管壁肺组织细胞凋亡的作用相关。 【 参考