流式微珠阵列法检测IFN.docVIP

　　流式微珠阵列法检测IFN 【摘要】 本 研究 旨在探讨流式微珠阵列法检测Th1/Th2细胞因子表达及IFN-γ 应用 于T淋巴细胞白血病 治疗 的临床价值。以不同浓度IFN-γ诱导培养Jurkat细胞48小时，用流式微珠阵列法检测培养上清液中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ表达，并采用流式细胞术检测膜上IL-2受体（CD25）的表达。结果表明： IFN-γ诱导Jurkat细胞IL-2和TNF-α的表达呈浓度依赖性升高，未检测到IL-6表达，CD25表达明显升高。结论： Jurkat细胞能被IFN-γ诱导高表达Th1细胞因子和CD25，流式微珠阵列法能准确客观地反映Th1/Th2细胞因子表达的动态变化。 【关键词】 T淋巴细胞白血病 　　Detection of Expression of Th1/Th2 Cytokines in Jurkat cell Treated etric Bead Array 　　Abstract In order to explore the value of γ-interferon (IFN-γ) in therapy of T lymphoid leukemia and role of cytometric bead array (CBA) method in detection of Th1/Th2 cytokines expression，the Jurkat cells ethod; CD25 expression etry. The results shoembrane receptor (CD25)，and the CBA method can be used to exactly evaluate the dynamic change of Th1/Th2 cytokines. 　　Key etric bead array; Th1/Th2 cytokine; IFN－γ; T lymphoid leukemia 流式微珠阵列（cytometric bead array，CBA）是近年来 发展 起来的新技术，可在一份标本中同时检测多达10种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10），具有快速、简便、准确的特点，而且灵敏度高（可达0.3 pg/ml），可以准确反映Th1/Th2平衡状态［1-4］。有学者认为，IFN-γ可应用于T淋巴细胞白血病治疗，但 目前 为止并无确凿的实验证据。Jurkat细胞株为T淋巴瘤研究常用模型，因此本研究组以流式微珠阵列法检测IFN-γ诱导的Jurkat细胞Th1/Th2细胞因子表达，同时检测mIL-2R（IL-2膜上受体，CD25）表达，探讨IFN-γ的抗肿瘤效应及作用机制。 　　材料和 方法 　　材料 　　RPMI 1640液体培养基（杭州科达生物公司产品），临用前加入15%小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）； Jurkat 细胞株（ 中国 科学 院上海细胞生物学研究所提供）； IFN-γ（上海克隆生物高技术有限公司生产）； 流式微珠阵列细胞因子检测试剂盒（Bender Medsystems产品，Austria）；CD25 FITC单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司产品）。 细胞培养 　　以含15%灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养Jurkat细胞，每2-3天换液，取对数生长期的细胞进行实验。 　　给药处理 　　IFN-γ以完全RPMI 1640培养液配成1×106 U/ml 　　贮存液，4℃避光保存。以1×106/ml浓度接种对数生长期细胞于6孔板中，培养6小时后给药。各孔药物终浓度分别为0(对照组)、1 000、2 000、4 000、6 000、10 000 U/ml，继续培养48小时，收集细胞用于CD25检测，细胞培养上清液用于细胞因子检测。 　　IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2的流式微珠阵列检测 　　按试剂盒操作说明准备好检测缓冲液、微珠、生物素偶联剂和亲和素标记藻红蛋白（phycoerythrin，PE)，以检测缓冲液预湿微孔板，加入不同浓度细胞因子标准品或25 μl待测细胞培养上清液，同时每孔加入25 μl微珠和50 μl生物素偶联剂，室温振摇（500 rpm）孵育2小时，真空吸干液体，充分洗涤2次，每孔加入100 μl检测缓冲液和50 μl亲和素标记PE，继续孵育1小时，真空吸干液体后洗涤2次，加入200 μl检测缓冲液并转移到试管中，FACScan (Becton Dickinson，USA) 流式细胞仪测定荧光强度，荧光通道为FL-2，采用Floix