糖基转移酶2基因silD在大肠埃希菌中的克隆与表达.docVIP

　　糖基转移酶2基因silD在大肠埃希菌中的克隆与表达 作者：洪文荣 曾志红 朱春宝 陈代杰 朱宝泉 【摘要】 从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)扩增参与西索米星生物合成的糖基转移酶基因silD(1181bp)，并分别将其克隆到pUC18和表达载体pET30a上。其开放性阅读框长1173bp，编码含390aa(43.04ku)的多肽链，在大肠埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中实现表达。基因silD的碱基序列与gntD(来自M.echinospora)的碱基序列的同源性高达94%。预测的SilD蛋白序列与GntD的同源性为98%。这是继从依纽小单孢菌克隆参与生物合成西索米星的抗性基因srm1(AY661430)、西索米星2脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)和糖基转移酶基因sisZ(DQ250994)后，克隆到的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 【关键词】 糖基转移酶2基因； 伊纽小单孢菌； silD； 克隆与表达 ABSTRACT The gene silD, a novel glycosyl transferase2 gene, ent containing silD (1185bp) gene (the key gene involved in sisomicin biosynthesis) Micromonospora inyoensis and cloned into pUC18 vector. Its ORF is posed of 1,173 bp, encoding 390aa (43.04ku). Sequence analysis verified that silD gene and amino acids sequence shoicin biosynthesis from M.echinospora), respectively. The prediction of structure of silD suggested it is also a glycosyl transferase protEin. The silD expression vector pETsilD id. The silD protEIn onospora inyoensis. The silD is a novel gene after cloning the sisomicin resistance gene srm1, glycosyl transferase gene sisZ and 2deoxy scyllo inosose synthase gene sisB from Micromonospora inyoensis. KEY icromonospora inyoensis; silD; Clone and expression 放线菌中的小单孢菌属微生物能产生重要的氨基糖苷类抗生素，而氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物。伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)产生的西索米星及其相关的衍生物奈替米星被誉为第三代氨基糖苷类抗生素，是氨基糖苷类抗生素中不良反应最少、抗铜绿假单胞菌作用最强、抗钝化酶能力最广的抗生素，世界卫生组织(.inyoensis)TS388由福州大学提供；大肠埃希菌BL21(DE3)、大肠埃希菌DH5a和质粒pUC18均由上海来益生物药物研发中心提供；表达载体为pET30a购自Novagen公司。其它常用化学药品及试剂购自上海生物工程公司和华美公司。 1.1.2 培养基 LB培养基［12］根据需要添加氨苄西林(终浓度100mg/ml)和卡那霉素(终浓度50μg/ml)；用于伊纽小单孢菌TS388生长的培养基见 2.3 基因silD的核苷酸序列在核苷酸水平的比较不重要应简略及其氨基酸序列分析 来自伊纽小单孢菌的扩增DNA片段(EcoRIPstI)总长1181bp。借助vector NTI软件寻找开放性阅读框(ORF)，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，其orf总长1173bp(1～1173bp)。根据silD基因与gntD所具有的高度同源性，并参照gntD基因的研究结果，认为silD基因是依纽小单孢菌生物合成基因簇中的合成西索米星的重要基因：糖基转移酶基因2。基因silD的核苷酸序列、氨基酸序列等详细情况可登录GenBank查找(DQ250992)。 silD表达的蛋白由390个氨基酸(aa)组成，其蛋白分子质量约为43.04ku，等电点为6.46。对silD密