第六章蛋白质的测定.ppt

蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm） 双缩脲法对白、红蛋白产生的颜色反应相近，不受温度影响。可快速测定蛋白质含量，但灵敏度低，测定范围为1～20mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定，常用于谷物蛋白质含量测定。 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等对本反应有干扰。 3）酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油 、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇）EDTA和脲素均会干扰反应。但质量分数或体积分数在5％时，尿素、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸、乙醇、乙醚和丙酮对显色无影响，高浓度时必须作校正曲线。 应用： 紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。 4、不同来源蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合状况有一定差异。 2.试剂 Folin-酚试剂 试剂甲： （A）称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。 （B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。 每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲。 试剂乙： 在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠和700mL蒸馏水，25g钼酸钠，再加50mL 85 ％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。 回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。 3.试验方法 (1) 标准曲线的制作 配制标准牛血清白蛋白溶液：250μg/mL的牛血清白蛋白溶液，取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加水定容至1.0mL,配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。 →然后各加Folin-酚试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min， →再各加0.5 mLFolin-酚试剂乙，立即混合均匀，静止30min后。 →以不含蛋白质的1号试管为对照，用分光光度计于750nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。 (2) 样品的提取及测定 →准确称取样品1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管. →离心4 000r/min、20min。 →将上清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。 (3)取普通试管2支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于750nm波长下测定光密度，并记录结果。 计算 从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg），再计算样品中蛋白质的百分含量。 蛋白质含量（％）=[X（μg）×稀释倍数]÷(样品重×106) 试验注意事项 （1）Folin乙试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。 （2） Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，不同蛋白质含量不同而使显色强度稍有不同。本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。 四．紫外吸收法 1.原理： 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，在蛋白质浓度3~8mg/mL OD280nm光密度与其浓度呈正比关系，可作定量测定。 2.试剂 （1）标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。 （2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/mL左右的溶液。 3.实验方法 (1) 标准曲线制作 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，分别向每支试管内加入0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0mL溶液，加蒸馏水定容到5.0mL,混匀。 以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。 (2) 样品测定 取待测蛋白