补骨脂汤对痴呆大鼠海马NR2B、BDNF-TrkB表达的影响.docVIP

　　补骨脂汤对痴呆大鼠海马NR2B、BDNF/TrkB表达的影响 作者：郑里翔，崔志远，郭慧君，余世平 【摘要】 目的为探讨补骨脂汤对改善血管性痴呆大鼠的空间学习记忆的机理。方法用双侧结扎颈动脉反复灌注，用Morris试验测试大鼠的空间学习记忆，RT-PCR测定与学习记忆密切相关的NR2B、BDNF/TrkB基因表达产物。结果补骨脂汤高、低剂量组的逃避潜伏期都明显短于模型组（Plt;0.01），补骨脂汤高、低剂量，均可明显提高NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达（Plt;0.05）。结论补骨脂汤能明显改善血管性痴呆大鼠的空间记忆，其可能的机制是通过提高NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达水平而发挥作用的。 【关键词】 补骨脂汤；血管性痴呆；NR2B； BDNF/TrkBmRNA Abstract：ObjectiveTo elucidate the mechanism of BuGuZhi Decoction hoprove vascular dementia rats on spatial learning and memory.MethodsExperimental VD model rats on carotid arteries ligation and reperfusion, the performance of spatial learning and memory of all rats easured using the Morris aze.DAR2、BDNF/TrkB基因表达产物入手，进一步阐明作用途径，为其临床应用提供实验依据。 　 　1 材料与仪器 　　1.1 动物实验动物选用SD大鼠60只(购于南昌大学医学院动物中心)，雌雄各半，体质量160～180g。 　　1.2 中药由江西中医学院附属 医院 药房提供。 　　1.3 仪器及试剂水迷宫实验装置，PCR扩增仪,核酸电泳槽，DPG-900型凝胶图像分析系统，净化台，DYY-5型电泳仪。Trizol及Taq酶均自美国Invitrogen公司，其他化学试剂都是国产试剂。 　　 2 方法 　　2.1 分组把60只大白鼠随机分成5组，每组雌雄各半，分别为假手术组，模型组，中成药组，补骨脂汤低剂量组，补骨脂汤高剂量组。 　　2.2 造模在造模前补骨脂汤高、低剂量组用补骨脂汤灌胃7 d，第8天对5组进行手术造模，用2﹪的戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，75﹪酒精消毒颈前皮肤，颈正中切口分离双侧颈总动脉穿线备用，用无创动脉夹夹闭一侧颈总动脉10min,去夹后立即关闭另一侧颈总动脉，每侧夹闭1次，每次10min，去动脉夹撤线缝合皮肤，在手术部位撒一层青霉素粉末。假手术组只进行颈总动脉的分离不夹闭血管，各组手术造模后待大鼠苏醒然后放回笼中保温饲养。 　　2.3 给药方法 　　术后第3天开始给药，中成药组剂量予银杏叶片7.2mg/(kg·d),补骨脂汤低剂量组剂量予9.82mg/(kg·d)，高剂量组剂量予19.64mg/(kg·d)，2次/d，连续25d。 　　2.4 Morris实验 　　将大鼠面向池壁置于象限1/2弧度处入水，经120s未找到站台的大鼠，将其引至站台停留10s,引导其学习记忆，各组大鼠每天训练2次，共训练6d，记录大鼠找到平台的确切时间。在整个实验中，实验者要与动物视线隔开，室内要保持安静及周围环境的相对稳定。 　　2.5 半定量的RT-PCR 　　按照TRIZOL试剂说明书提取总RNA，在20μl反转录反应体积中进行反转录，合成cDNA。取上述逆转录产物PCR扩增NR2B、BDNF、TrkB。NR2B：Forer:5’GCTCAGCGACCTGTATGG3’，Reverse primer:5’AGGCGAGTTCTCCTTTGTT3’，产物长度331bp；BDNF：Forer:5’TTATTTCATACTTCGGTTGC3’， Reverse primer:5’ATGGGATTACACATTGGTCTC3’,产物长度547bp； TrkB：Fore:5’GGCTTATGCTTGCTGGTC3’,Reverseprimer:5’CTGGGTCAATGCTGTTAGGT3’,产物长度148bp。25 μl PCR反应体系中进行PCR反应（NR2B mRNA、BDNF mRNA、TrkB mRNA:95℃ 5min, 94℃ 30s, 53℃ 20s,72℃ 30s,30个循环，72℃终延伸5min；GAP-43mRNA：95℃ 5min, 94℃ 30s, 55℃ 20s,72℃ 30s,30个循环，72℃终延伸5min ）。PCR产物用2﹪琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳分离，用凝胶图形分析系统进行拍照，观察结果并测定灰度值